技术摘要：
本发明公开了一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用，其中，羰基还原酶EbSDR8的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上存在第70位天冬酰胺和第137位丝氨酸的两点组合突变；其中，第70位天冬酰胺突变为缬氨酸，第137位丝氨酸突变为苯丙氨酸，所述突变体的氨基酸 全部
背景技术：
手性醇及其衍生物是重要的手性中间体，在合成手性药物、手性农药和液晶材料 等众多化工产品中应用广泛。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法， 理论上能将底物酮100％转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。酶和微生 物细胞作为生物催化剂用于高效制备手性醇已经受到广泛关注，生物催化潜手性酮不对称 还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为手 性醇绿色合成的优选途径。 潜手性铜的不对称还原是不对称合成的基本反应之一，也是制备光学活性手性醇 的重要方法。在不对称还原潜手性酮的生物酶中，短链脱氢酶因其具有催化底物谱广、热稳 定性好以及有机溶剂耐受性强等特点而备受关注。短链脱氢酶催化潜手性酮还原制备高光 学纯度手性醇已有诸多报道。目前，已有实验筛选得到一株能够以anti-Prelog立体选择性 催化潜手性酮还原的菌株——短稳杆菌ZJUY-1401(Empedobacter brecis ZJUY-1401)；并 从其基因组中挖掘并克隆表达了遵循anti-Prelog规则高立体选择性还原潜手性酮的短链 脱氢酶EbSDR8。但是该短链脱氢酶在催化脂肪族潜手性仲酮(如2-己酮，2-庚酮，2-辛酮)时 活性较低，因此有必要通过相关技术提高该酶在催化脂肪族潜手性仲酮上的效率以充分发 掘其应用价值。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种羰基还原酶EbSDR8 突变 体及其构建方法和应用，提高羰基还原酶EbSDR8的催化活性，更好的挖掘其工业化应用的 价值。 本发明提供一种羰基还原酶EbSDR8突变体，该羰基还原酶EbSDR8具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。羰基还原酶EbSDR8突变体 是在SEQ ID NO.2所示羰基还原酶EbSDR8氨基酸序列基础上含有如下几个位点的单点突变 或多点组合突变：70位天冬酰胺、91 位丙氨酸、124位赖氨酸、137位丝氨酸，但91位丙氨酸 和124位赖氨酸处突变体的催化效果较差。 具体地，在羰基还原酶EbSDR8的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上存在 第70位天冬酰胺和第137位丝氨酸的两点组合突变；其中，第70位天冬酰胺突变为缬氨酸， 第137位丝氨酸突变为苯丙氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。组合突变 与第70位天冬酰胺或第137位丝氨酸的单点突变相比，具有更优的催化活性。 本发明还提供一种羰基还原酶EbSDR8突变体的构建方法，包括以下步骤： (1)确定羰基还原酶EbSDR8突变位点为如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的70为天 4 CN 111575258 A 说 明 书 2/6 页 冬酰胺、169为苯丙氨酸，设计突变引物；其中，突变引物为： N70V-F：CGAAGAGGTTGAAGCGTTGGTAAAAAAAG； N70V-R：ACGCTTCAACCTCTTCGGGAGATGATGT； S137F-F：GGAGGTTTTATTGTGAATATGGCCTCAAT； S137F-R：CACAATAAAACCTCCACCATTTTTCTCCAT。 然后进行突变PCR，其中突变PCR的反应条件为：在98℃条件下预变性 1min；再进 入温度循环98℃、10s，55℃、10s，72℃、7min，循环20次后冷却至4℃。 具体地，羰基还原酶EbSDR8突变体的编码基因中，突变体N70V核苷酸序列如序列 表中SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6 所示；突变体S137F核 苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。 突变体N70V/S137F核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示，其编码的氨基酸序列如序列 表SEQ ID NO.8所示。 其中，通过本领域常规方法可以将羰基还原酶突变体的基因连接于各种载体上完 成重组表达载体的构建。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒 载体等，本发明优选pET-30a。 (2)将PCR后的重组表达载体进行DpnI酶切处理并转化至宿主微生物中，获得基因 工程菌； (3)将步骤(2)中获得的基因工程菌接种至培养基中培养，在异丙基-β -D-硫代吡 喃半乳糖苷的诱导下，表达重组羰基还原酶突变体。具体地，将培养重组表达转化体，诱导 获得重组羰基还原酶突变体蛋白。 其中，羰基还原酶突变体可以以游离酶、固定化酶以及重组游离细胞的形式催化 合成光学活性手性醇。 再进一步，所述步骤(1)中的突变PCR的反应条件为：在98℃条件下预变性1min；再 进入温度循环98℃、10s，55℃、10s，72℃、7min，循环20次后冷却至4℃。 进一步，所述步骤(3)的具体实施步骤如下： (a)斜面培养：将含所述羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的所述重组基因工程 菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养12～16h，获得斜面菌体； (b)种子培养：将所述斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子 液； (c)发酵培养：将所述种子液以体积浓度10％的接种量接种至无菌发酵罐中，37℃ 发酵培养至OD600达到0.6～0.8时，将终浓度为0.1～10mM异丙基- β-D-硫代吡喃半乳糖苷 添加到所述无菌发酵罐中于26℃下诱导培养。 羰基还原酶EbSDR8突变体在脂肪族潜手性仲酮还原中的应用，脂肪族潜手性仲酮 为底物，EbSDR8突变体为催化剂，20～50℃下于PH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体 系中反应。反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。 进一步，所述转化反应体系中，所述脂肪族潜手性仲酮的初始浓度为 10～ 1000mmol/L。转化反应体系中羰基还原酶EbSDR8突变体菌体的质量用量以菌体湿重计的浓 度为10～500g/L。 再进一步，所述转化反应体系中所述羰基还原酶EbSDR8突变体的浓度为 10～ 5 CN 111575258 A 说 明 书 3/6 页 500g/L，所述羰基还原酶EbSDR8突变体以含有羰基还原酶EbSDR8突变体的基因工程菌诱导 培养得到的湿菌体形式提供。 进一步，所述转化反应体系中还包括二甲亚砜、异丙醇、甲醇中的一种或多种有机 溶剂。优选的为异丙醇，反应体系中异丙醇的浓度为30％。 相比现有技术，本发明的有益效果在于： 本发明中提供的羰基还原酶EbSDR8突变体及羰基还原酶EbSDR8突变体的构建方 法中，使得羰基还原酶EbSDR8获得活性较高的突变位点，从而使羰基还原酶EbSDR8对催化 合成脂肪族手性仲酮具有更优良的催化活性，羰基还原酶EbSDR8突变体催化合成脂肪族手 性仲酮的浓度在100～300g/L，转化率达 70％～99.9％，产率75％～98％，光学纯度大于 99％，具有很好的应用开发前景。
本发明公开了一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用，其中，羰基还原酶EbSDR8的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上存在第70位天冬酰胺和第137位丝氨酸的两点组合突变；其中，第70位天冬酰胺突变为缬氨酸，第137位丝氨酸突变为苯丙氨酸，所述突变体的氨基酸 全部
背景技术：
手性醇及其衍生物是重要的手性中间体，在合成手性药物、手性农药和液晶材料 等众多化工产品中应用广泛。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法， 理论上能将底物酮100％转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。酶和微生 物细胞作为生物催化剂用于高效制备手性醇已经受到广泛关注，生物催化潜手性酮不对称 还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为手 性醇绿色合成的优选途径。 潜手性铜的不对称还原是不对称合成的基本反应之一，也是制备光学活性手性醇 的重要方法。在不对称还原潜手性酮的生物酶中，短链脱氢酶因其具有催化底物谱广、热稳 定性好以及有机溶剂耐受性强等特点而备受关注。短链脱氢酶催化潜手性酮还原制备高光 学纯度手性醇已有诸多报道。目前，已有实验筛选得到一株能够以anti-Prelog立体选择性 催化潜手性酮还原的菌株——短稳杆菌ZJUY-1401(Empedobacter brecis ZJUY-1401)；并 从其基因组中挖掘并克隆表达了遵循anti-Prelog规则高立体选择性还原潜手性酮的短链 脱氢酶EbSDR8。但是该短链脱氢酶在催化脂肪族潜手性仲酮(如2-己酮，2-庚酮，2-辛酮)时 活性较低，因此有必要通过相关技术提高该酶在催化脂肪族潜手性仲酮上的效率以充分发 掘其应用价值。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种羰基还原酶EbSDR8 突变 体及其构建方法和应用，提高羰基还原酶EbSDR8的催化活性，更好的挖掘其工业化应用的 价值。 本发明提供一种羰基还原酶EbSDR8突变体，该羰基还原酶EbSDR8具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。羰基还原酶EbSDR8突变体 是在SEQ ID NO.2所示羰基还原酶EbSDR8氨基酸序列基础上含有如下几个位点的单点突变 或多点组合突变：70位天冬酰胺、91 位丙氨酸、124位赖氨酸、137位丝氨酸，但91位丙氨酸 和124位赖氨酸处突变体的催化效果较差。 具体地，在羰基还原酶EbSDR8的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上存在 第70位天冬酰胺和第137位丝氨酸的两点组合突变；其中，第70位天冬酰胺突变为缬氨酸， 第137位丝氨酸突变为苯丙氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。组合突变 与第70位天冬酰胺或第137位丝氨酸的单点突变相比，具有更优的催化活性。 本发明还提供一种羰基还原酶EbSDR8突变体的构建方法，包括以下步骤： (1)确定羰基还原酶EbSDR8突变位点为如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的70为天 4 CN 111575258 A 说 明 书 2/6 页 冬酰胺、169为苯丙氨酸，设计突变引物；其中，突变引物为： N70V-F：CGAAGAGGTTGAAGCGTTGGTAAAAAAAG； N70V-R：ACGCTTCAACCTCTTCGGGAGATGATGT； S137F-F：GGAGGTTTTATTGTGAATATGGCCTCAAT； S137F-R：CACAATAAAACCTCCACCATTTTTCTCCAT。 然后进行突变PCR，其中突变PCR的反应条件为：在98℃条件下预变性 1min；再进 入温度循环98℃、10s，55℃、10s，72℃、7min，循环20次后冷却至4℃。 具体地，羰基还原酶EbSDR8突变体的编码基因中，突变体N70V核苷酸序列如序列 表中SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6 所示；突变体S137F核 苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。 突变体N70V/S137F核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示，其编码的氨基酸序列如序列 表SEQ ID NO.8所示。 其中，通过本领域常规方法可以将羰基还原酶突变体的基因连接于各种载体上完 成重组表达载体的构建。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒 载体等，本发明优选pET-30a。 (2)将PCR后的重组表达载体进行DpnI酶切处理并转化至宿主微生物中，获得基因 工程菌； (3)将步骤(2)中获得的基因工程菌接种至培养基中培养，在异丙基-β -D-硫代吡 喃半乳糖苷的诱导下，表达重组羰基还原酶突变体。具体地，将培养重组表达转化体，诱导 获得重组羰基还原酶突变体蛋白。 其中，羰基还原酶突变体可以以游离酶、固定化酶以及重组游离细胞的形式催化 合成光学活性手性醇。 再进一步，所述步骤(1)中的突变PCR的反应条件为：在98℃条件下预变性1min；再 进入温度循环98℃、10s，55℃、10s，72℃、7min，循环20次后冷却至4℃。 进一步，所述步骤(3)的具体实施步骤如下： (a)斜面培养：将含所述羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的所述重组基因工程 菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养12～16h，获得斜面菌体； (b)种子培养：将所述斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子 液； (c)发酵培养：将所述种子液以体积浓度10％的接种量接种至无菌发酵罐中，37℃ 发酵培养至OD600达到0.6～0.8时，将终浓度为0.1～10mM异丙基- β-D-硫代吡喃半乳糖苷 添加到所述无菌发酵罐中于26℃下诱导培养。 羰基还原酶EbSDR8突变体在脂肪族潜手性仲酮还原中的应用，脂肪族潜手性仲酮 为底物，EbSDR8突变体为催化剂，20～50℃下于PH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体 系中反应。反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。 进一步，所述转化反应体系中，所述脂肪族潜手性仲酮的初始浓度为 10～ 1000mmol/L。转化反应体系中羰基还原酶EbSDR8突变体菌体的质量用量以菌体湿重计的浓 度为10～500g/L。 再进一步，所述转化反应体系中所述羰基还原酶EbSDR8突变体的浓度为 10～ 5 CN 111575258 A 说 明 书 3/6 页 500g/L，所述羰基还原酶EbSDR8突变体以含有羰基还原酶EbSDR8突变体的基因工程菌诱导 培养得到的湿菌体形式提供。 进一步，所述转化反应体系中还包括二甲亚砜、异丙醇、甲醇中的一种或多种有机 溶剂。优选的为异丙醇，反应体系中异丙醇的浓度为30％。 相比现有技术，本发明的有益效果在于： 本发明中提供的羰基还原酶EbSDR8突变体及羰基还原酶EbSDR8突变体的构建方 法中，使得羰基还原酶EbSDR8获得活性较高的突变位点，从而使羰基还原酶EbSDR8对催化 合成脂肪族手性仲酮具有更优良的催化活性，羰基还原酶EbSDR8突变体催化合成脂肪族手 性仲酮的浓度在100～300g/L，转化率达 70％～99.9％，产率75％～98％，光学纯度大于 99％，具有很好的应用开发前景。
