技术摘要：
一种包膜替换型病毒载体疫苗，以水泡性口炎病毒VSV为载体，将VSV病毒基因组中的GP基因替换为冠状病毒的刺突蛋白S基因的截短体或病毒刺突蛋白S基因的胞外段与GP‑C段融合体ECD‑CA，刺突蛋白S基因截短体选自C端部分氨基酸缺失的基因，ECD‑CA为病毒刺突蛋白S基因的胞外  全部
背景技术：
世界卫生组织(WHO)近期宣布2019冠状病毒病(Covid-19)构成国际关注的突发公 共卫生事件，截至2020年3月24日,全球共有38万例实验室确诊病例。在近期的研究中,一些 Covid-19病例的严重程度与SARS-CoV相似，鉴于Covid-19的迅速传播,针对新冠病毒的疫 苗已经迫在眉睫。 冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(order  Nidovirals)、 冠状病毒科(family  Coronavirade)、冠状病毒属(genus  Coronavirus)的成员，基因组为 单股、正链的RNA，基因组全长在26～32kb之间，是目前已知基因组最大的RNA病毒。冠状病 毒在自然界的感染普非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以及家禽类都易感。 冠状病毒按照核酸序列的系统发生分析，国际病毒学分类委员会(ICTV，2012)在 第九次报告中将冠状病毒属成员分成了α组、β组、γ组和δ组共四组。人冠状病毒主要分布 于α组和β组。其中，HCoV-229E和HCoV-NL63位于α组，HCoV-OC43和HCoV-HKU1位于β组中的2a 亚组，MERS-CoV属于β组中的2c亚组，而最新席卷全球的SARS-CoV-2与SARS属于β组中的2b 亚组。 最新研究表明，该病毒的S刺突蛋白RBD段结合ACE2的能力是SARS的10倍之多，传 播能力是目前已知主要的七种感染人的冠状病毒中最强的。SARS-CoV-2与SARS冠状病毒的 结构相似，体现在病毒表面的棘突蛋白S蛋白是病毒包膜上特异性的组织结构，在病毒的表 面形成了大量的刺突蛋白，在病毒入侵靶细胞以及病毒与细胞识别时发挥着重要作用。 新冠疫情全球范围大爆发致使针对新冠肺炎的药物研制已刻不容缓，美国医学会 杂志JAMA研究报道结果表明一部分康复患者仍是新冠病毒携带者，进而也引发了新型冠状 病毒是否已成为一种全球流行病的讨论，新冠病毒可能像流感病毒一样，长期流行于人类 社会，而包膜替换型病毒载体已经被证实是最具成本效益、最有效和最持久的疾病预防、控 制措施，因而全民接种新冠包膜替换型病毒载体势在必行，短期内研发并投放新冠肺炎包 膜替换型病毒载体是阻止疫情蔓延的有力手段。 研究表明，当前导致严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病 毒、严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)等均通过粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃肠道)入侵 和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答清除粘膜感染病原体，使病原体迅速 扩散入血、进而侵犯全身，造成机体尤其是肺组织的损伤。 已知常规包膜替换型病毒载体如灭活、蛋白包膜替换型病毒载体、DNA包膜替换型 病毒载体、亚单位包膜替换型病毒载体等，经常规途径免疫(肌肉注射、皮下等)通常不能诱 导特异性粘膜免疫应答。无论包膜替换型病毒载体的形式是什么，要诱导粘膜免疫应答通 常需要将靶抗原从粘膜部位接种，才能有效被粘膜组织中的APC摄取并递呈，进一步激活粘 4 CN 111603557 A 说　明　书 2/11 页 膜免疫系统，诱导有效持久的粘膜免疫应答。 已知的包膜替换型病毒载体-水泡性口炎病毒(VSV)野毒株，在自然环境中可以感 染多种动物和昆虫。家畜中自然感染VSV的有马、牛(羊)、猪，而人群中自然状态下不存在水 泡性口炎病毒主动感染，因此也避免了预存抗体对病毒载体疫苗的药效影响(人体内预存 在对腺病毒、痘病毒的中和抗体)， 因此将水泡性口炎病毒(VSV)作为包膜替换型病毒载体与其它病毒载体相比，具 备天然的优势，可以完整的将冠状病毒的S蛋白展露在病毒表面，重组病毒无需通过感染宿 主细胞，转录翻译外源病毒抗原蛋白，可直接在细胞外被免疫系统识别，并激活抗病毒的先 天和后天特异性免疫应答，缩短抗病毒的反应时间，因此可以推论VSV作为病毒载体采用基 因编辑技术通过将冠状病毒的包膜蛋白S展示在病毒表面，会显著增强机体的免疫应答的 强度，诱导更强的后天性抗病毒反应(T细胞免疫应答和B细胞免疫应答)。 本发明利用VSV病毒载体的天然优势提出一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建 方法，该类包膜替换型病毒载体疫苗对人患冠状病毒尤其是SARS或者新冠肺炎病毒(SARS- CoV-2)有较好的预防或治疗作用。
技术实现要素：
一种包膜替换型病毒载体疫苗，所述包膜替换型病毒载体疫苗是将弹状病毒基因 组中的GP基因替换为冠状病毒的刺突蛋白S基因截短体或病毒刺突蛋白S基因的胞外段融 合体ECD-CA，并利用反向遗传系统构建得到的用于预防冠状病毒的包膜替换型病毒载体疫 苗，所述ECD-CA定义为病毒刺突蛋白S基因的胞外段ECD融合VSV病毒囊膜蛋白的跨膜和胞 内段基因后的基因。 优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒 VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因选自SARS或SARS-CoV-2冠状病毒，所述 刺突蛋白S基因截短体选自C端氨基酸缺失对应的基因，所述C端氨基酸缺失个数为18～72 个。 优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述刺突蛋白S基因截短体选自C端缺失 的基因，所述C端氨基酸缺失数目优选30个，且对应修饰后的刺突蛋白S对应的氨基酸序列 为SEQ  ID  NO.1。 优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒 VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因的胞外段融合体ECD-CA选自冠状病毒， 所述ECD-CA包含冠状病毒刺突蛋白S基因的胞外段ECD，所述ECD的C端融合了VSV的囊膜蛋 白的跨膜和胞内段基因CA。 优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述ECD-CA克隆到VSV基因组中M基因和L 基因之间的编码序列中，所述ECD-CA氨基酸序列为SEQ  ID  NO.2,所述ECD-CA人源化密码子 基因序列为SEQ  ID  NO.3。 优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述水泡性口炎病毒是其基质蛋白M的氨 基酸发生突变后得到的病毒，所述基质蛋白M中氨基酸突变位点为第20位的亮氨酸、第51位 甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸中的一个或多个且为非同义突变。所述第20位的亮氨酸、第 51位甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸突变后对应的氨基酸可与下段中所述突变后氨基酸的 5 CN 111603557 A 说　明　书 3/11 页 种类对应相同或不同。 优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述病毒载体是减毒水泡性口炎病毒，所 述水泡性口炎病毒的基质蛋白M发生3位点氨基酸的突变，所述基质蛋白M的第20位由亮氨 酸L突变为苯丙氨酸F、第51位由甲硫氨酸M突变为丙氨酸A、第110位由苯丙氨酸F突变为亮 氨酸L，所述的3位点突变的基质蛋白M氨基酸序列为SEQ  ID  NO.4。 一种包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，包括如下步骤： S1、利用合成生物学得到上述任一所述冠状病毒的S-CN截短体基因或上述任一所 述ECD-CA包膜基因，基因片段用MluI和XhoI双酶切克隆至pVSV-3M质粒多克隆位点中，分别 得到pCore-3M-S-CN或pCore-3M-ECD-CA质粒，其中所述冠状病毒的S-CN定位为冠状病毒刺 突蛋白S基因在C端缺失N个氨基酸后对应的基因序列缩写，所述其中N＝18～72中的任一自 然数； S2、用表达T7-RNA聚合酶的质粒pCAGGS-T7瞬转ACE2稳定表达的细胞；所述的ACE2 稳定表达的细胞优选自293T-hACE2，转染24h后将内毒素去除的质粒包括pCAGGS-P、 pCAGGS-N、pCAGGS-L及pCore-3M-S-CN或pCore-3M-ECD-CA的质粒制备转染混合液； S3、对四质粒进行脂质体包裹共转染72h后，将上清液通过0.22um的滤膜过滤后加 入到对数生长期的293T-ACE2细胞中； S4、细胞出现病变，则收集细胞上清液，利用RT-PCR技术进行病毒基因组中包膜替 换目的基因拷贝数的鉴定； S5、用293-ACE2稳定表达的细胞进行空斑纯化，经蛋白免疫印迹鉴定后得所述冠 状病毒包膜替换型疫苗VSV-△G-S-CN或VSV-△G-ECD-CA。 优选的，所述的冠状病毒包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，步骤S4中所述RT- PCR中特异性扩增冠状病毒S-CN基因的荧光探针引物对为序列SEQ  ID  NO.5、SEQ  ID  NO.6。 优选的，所述的冠状病毒包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，RT-PCR中特异性 扩增冠状病毒ECD-CA基因的荧光探针引物对为SEQ  ID  NO.7、SEQ  ID  NO.8。 优异性： 与传统的病毒载体疫苗相比，本发明首次借助VSV病毒包装系统，通过大量的基因 优化及构建，体外筛选出可以高效包装出冠状病毒包膜替换型重组病毒，涉及到特定的包 膜基因修饰体(S-CN和ECD-CA)，冠状病毒包膜完整的包裹在VSV的遗传物质外，与传统病毒 载体疫苗相比(感染宿主细胞后才能转录翻译病毒抗原)可以将高免疫原性的抗原递呈给 免疫细胞，缩短了宿主免疫系统的反应时间，同时最大程度的保留了冠状病毒的最重要的 抗原蛋白S，与传统的复制缺陷的病毒载体疫苗(腺病毒载体)相比，本发明涉及到的冠状病 毒候选疫苗具备一定的复制能力(hACE2稳定表达的细胞系)，可规模化快速生产，同时作为 非灭活疫苗接种最高程度的模拟了冠状病毒侵染宿主细胞的整个过程(VSV结构蛋白对宿 主细胞没有显著毒性)，可以激活机体免疫系统产生高强度的抗新冠的中和抗体反应。 VSV包膜替换型病毒载体疫苗进一步采取粘膜部位接种的免疫方式，会诱导机体 产生更强的针对冠状病毒，尤其是新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)抗原蛋白S的特异性黏膜免 疫应答，当外来病原体通过黏膜侵入时，黏膜组织的会被激活，迅速将病原清除,进一步已 知VSV病毒载体还拥有其他工具载体不具备的特性，当设计的预防包膜替换型病毒载体是 用来预防有包膜的病毒时，VSV病毒可以将目的病毒的包膜蛋白完整的空间结构展示在病 6 CN 111603557 A 说　明　书 4/11 页 毒表面，充分将新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)的三聚体蛋白S充分展露在重组病毒的核衣壳 表面，进一步该技术类型的包膜替换型病毒载体在体外灭活后，仍具备有效激活机体的特 异性免疫应答，充分激活宿主免疫应答，同时重组病毒包膜替换型病毒载体作为灭活疫苗 接种后，不具备二次复制能力，进一步提高疫苗的安全性。 附图说明： 图1A是不同S截短体的S-CN和ECD-CA基因构建到弹状病毒骨架载体示意图,B是分 子生物克隆的流程验证图，C是蛋白免疫印迹法(Western  Blotting)检测包装拯救得到的 候选疫苗的目的蛋白的表达，D是不同修饰体的S包装出重组包膜替换型疫苗的荧光图； 图2筛选出包装效率滴度最高的2株包膜替换型候选疫苗，采取不同的疫苗接种方 式，21天后分别检测血清中IgA的含量(A)以及特异性的IgG的含量(B)； 图3将多种包膜替换型候选新冠疫苗免疫21天后的血清取出，体外利用基于慢病 毒开发的模拟的新冠假病毒作为检测工具，进行中和抗体效价比较； 图4弹状病毒载体的囊膜改造成为冠状病毒包膜的的示意图。 下面结合具体实施例对本公开做进一步的详细说明