技术摘要：
本发明提供一种合成包括重复单元的DNA序列的方法，所述方法包括基于所述重复单元设计和合成延伸引物和阻断引物，并且在PCR反应体系中通过使用所述重复单元(作为扩增模板)、延伸引物和阻断引物进行PCR扩增反应，获得所述包括重复单元的DNA序列。本发明还提供用于该方法 全部
背景技术：
近年来随着测序能力的提升，许多物种的基因组信息被破解，大量重复DNA序列被 陆续发现，且重复DNA序列的含量与物种进化成正相关，真核生物基因组中重复DNA序列的 种类及含量远远大于原核生物，因此预示着重复DNA元件与生物进化，复杂生物学功能直接 相关，具有非常强的生物学功能及研究意义。随着基因组学研究的深入，人们发现含有不同 拷贝数量的DNA双链序列在重结合动力学特征上存在显著区别，重复单元含量和拷贝数量 与重结合时间成负相关关系，因此根据动力学特征人们将DNA重复序列分为单拷贝重复序 列；低度重复序列；中度重复序列和高度重复序列。中度和高度重复序列元件与染色体构 建，结构维持和基因表达调整等生物学功能直接相关。另外由于中高度重复DNA分子之间具 有极强亲和自组装能力，因此中高度重复双链DNA分子往往也是极佳的生物兼容性材料的 构建基础分子。 综上所述，体外人工合成中高度重复DNA序列具有非常重要的生理学及材料学应 用价值，现有体外合成中度及高度重复DNA的方法较为有限，主要以RCA(滚环型扩增)和基 因合成拼接技术为主。 RCA技术主要借鉴病毒及原核生物质粒的环化扩增原理，通过连接酶将特定单链 DNA分子进行环化连接，获得环化DNA模板分子，然后使用与环化模板配对的单链DNA引物及 高效单链扩增酶(phi29)在等温环境下(25-37摄氏度)对环化模板进行循环复制，从而获得 与环化模板互补配对的重复单链DNA序列(如图1所示)。该方法需要经过单链模板环化；未 环单链DNA消除和环化扩增三步，操作步骤较为繁琐，且各个技术环所需生物活性酶费用较 高，严重限制了该方法的产业化，另外最终产物为单链重复DNA分子，后期改进方法MCH需要 额外添加更多的单链引物，从而获得DNA双链分子产物。RCA方法获得重复DNA分子拷贝数量 与反应时间成正相关，即只能通过控制反应时间来控制最终产物的拷贝数量，在实际操作 中产物长度难以预测性，难以精确控制产物重复序列的拷贝数量，缺乏实用性，故RCA扩增 法合成中高度重复DNA一直停止在实验室应用阶段，难以产业化。 随着高通量DNA引物合成技术的成熟，重叠区扩增基因拼接法逐渐成为基因合成 的主流(Gene SOE)。Gene SOE技术将长DNA片段分割成多级小片段，每个片段两侧存在特异 识别碱基序列，通过碱基互补原则在连接酶或扩增酶的协作下完成多级小片段的顺序组 装，最终获得长片段DNA基因序列(如图2所示)。重叠区域碱基长度及碱基配比，引物Tm值对 整个拼接效率产生至关重要的影响。然而，由于高重复DNA序列当拷贝数量达到一定阈值 时，DNA分子内部会产生碱基配对滑动及错配现象，严重影响扩增及连接效率，导致拼接效 率下降，错误率增加等问题，最终导致拼接法合成中高度重复DNA周期较长，碱基突变率高 3 CN 111575272 A 说 明 书 2/6 页 和拷贝数量难以控制等问题，最终影响重复DNA双链的合成。
技术实现要素：
为解决重复序列合成中所面临的高成本，周期长，错误率较高等问题，本发明人研 发了一种新型的体外快速合成中高度重复序列的方法。 本发明的方法是一种基于阻断PCR的重复扩增技术(Blocking PCR based Repeat Expansion(BPRE))，其基于普通的链式聚合酶扩增反应，使用三条互补配对的DNA引物序 列，在循环加热变性过程中阻断引物模板与重复单元模板实现空间位阻配对，暴露重复单 元引物3’端数个(例如6个)碱基，暴露的数个游离碱基基团与扩增引物(延伸引物)模板3’ 端互补碱基配对，形成引物二聚体形成，在扩增酶(Taq DNA聚合酶)的作用下完成二聚体的 双方向扩增，完成一个重复序列的积累延伸(如图3所示)。新生成的重复DNA双链序列再次 经历加热变性和降温复性过程，重复上述空间位阻及二聚体生成延伸过程，最终完成高度 重复DNA序列的累计增加，故该方法重复序列的累计与升降温循环数量成正相关。 因此，本发明提供以下各项： 1.一种合成包括重复单元的DNA序列的方法，所述方法包括以下步骤： 1)基于所述重复单元设计和合成延伸引物和阻断引物，其中所述阻断引物与所述 重复单元的互补序列的区别在于缺少互补序列的5’端的n个核苷酸(5’至3’方向)，所述延 伸引物与所述重复单元的互补序列的区别在于3’端增加了所述n个核苷酸(5’至3’方向)， 使得所述延伸引物和所述阻断引物两者当以5’至3’方向串联起来时正好是两个所述重复 单元的互补序列，其中n为3至20的整数，优选4至10的整数(例如4、5、6、7、8、9和10)；和 2)在PCR反应体系中，通过使用所述重复单元(作为扩增模板)、延伸引物(作为重 复单元延伸模版)和阻断引物进行PCR扩增反应，获得所述包括多个重复单元的DNA序列。在 PCR反应体系中，阻断引物首先与重复单元配对(由于所述阻断引物与所述重复单元的互补 序列的区别在于缺少互补序列的5’端的n个核苷酸(5’至3’方向)，因此重复单元的3’端的 所述n个核苷酸处于未配对状态)，然后延伸引物的3’端的所述n个核苷酸与重复单元上未 配对的核苷酸进行配对，之后进行PCR延伸扩增反应。 本发明所述的“包括多个重复单元的DNA序列”也称为重复序列。重复序列在基因 组中广泛存在，按照重复单元的排列方式，可将它分为串联重复序列和散在重复序列两大 类。串联重复序列就是重复单元首尾相连、串接在一起的重复序列。本发明的方法尤其适合 于合成串联重复序列。对于重复单元(RU)的长度没有特别限制，例如可以为3～100(例如， 20、30、40、50、60、70、80、90或100)个核苷酸，优选10～30个核苷酸，例如20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30个核苷酸。 2.根据以上1所述的方法，其还包括确定获得的DNA序列中所述重复单元的拷贝数 的步骤，优选通过凝胶电泳分析PCR产物的分子量或者通过DNA测序技术。本发明获得的DNA 序列中重复单元的拷贝数可以为2拷贝至数千拷贝，例如5-200个拷贝，例如10、20、30、40、 50、60、70、80、90和100个拷贝。 3.根据以上1所述的方法，其中在PCR反应体系中还包括PEG分子，优选其分子量为 2000～20,000Da，更优选为4,000Da、6,000Da或8,000Da，更优选其在PCR反应体系中的浓度 为4wt％至20wt％(例如4wt％，8wt％和12wt％)。 4 CN 111575272 A 说 明 书 3/6 页 4.根据以上3所述的方法，其中在PCR反应体系中还包括NaCl。在本发明的一个优 选实施方案中，使用新批次引物时测试添加不同浓度NaCl对反应产物的影响，选择最佳浓 度。优选在PCR反应体系中NaCl的使用浓度为20～80mM，优选30～60mM。 5.根据以上1所述的方法，其中在PCR反应体系中所述重复单元、延伸引物和阻断 引物的摩尔比为1:1-10:1-40，优选1:1:10。 6.根据以上1所述的方法，其中所述PCR扩增反应为两步法PCR或三步法PCR。 本发明的PCR反应体系可以通过本领域已知的任何合适的PCR方法进行PCR反应。 标准三步法PCR通常包括以下步骤： 1)DNA变性：(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA； 2)退火：(60℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链； 3)延伸：(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以dNTP为原料， 从引物的3’端开始以从5’→3’端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。 对于PCR产物的拷贝数，荧光素(溴化乙锭，EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手 段。电泳法检测法也是可用的检测方法。另外还有荧光探针检测法。 本发明优选采用两步法PCR，其与标准三步法PCR的主要区别在于： 1)步骤不同：两步法退火和延伸同时进行，以减少一次升降温过程，而三步法则分 两次完成； 2)用时不同：两步法减少一次升降温过程，提高了反应速度，用时较短。 7.根据以上1至6中任一项所述的方法，其中所述包括重复单元的DNA序列为低度 重复序列、中度重复序列或高度重复序列，优选中度重复序列或高度重复序列。 8 .一种用于合成包括重复单元的DNA序列的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应体 系，所述PCR反应体系包括用作扩增模板的所述重复单元，延伸引物和阻断引物，其中所述 阻断引物与所述重复单元的互补序列的区别在于缺少互补序列的5’端的n个核苷酸(5’至 3’方向)，所述延伸引物与所述重复单元的互补序列的区别在于3’端增加了所述n个核苷酸 (5’至3’方向)，使得所述延伸引物和所述阻断引物两者当以5’至3’方向串联起来时正好是 两个所述重复单元的互补序列，其中n为3至20的整数，优选4至10的整数(例如4、5、6、7、8、9 和10)。 9.根据以上8所述的试剂盒，其中： 1)在所述PCR反应体系中还包括PEG分子，优选其分子量为2000～20,000Da，更优 选为4,000Da、6,000Da或8,000Da，更优选其在PCR反应体系中的浓度为4wt％至20wt％(例 如4wt％，8wt％和12wt％)； 2)在所述PCR反应体系中还包括NaCl。使用新批次引物时测试添加不同浓度NaCl 对反应产物的影响，选择最佳浓度。优选NaCl在PCR反应体系中的使用浓度为20～80mM，优 选30～60mM； 3)在所述PCR反应体系中所述重复单元、延伸引物和阻断引物的摩尔比为1:1-10: 1-40，优选1:1:10；和/或 4)所述PCR反应体系中包括Taq DNA聚合酶。 10.根据以上8或9所述的试剂盒，其中所述包括重复单元的DNA序列为低度重复序 列、中度重复序列或高度重复序列，优选中度重复序列或高度重复序列。 5 CN 111575272 A 说 明 书 4/6 页 本发明的方法可以通过控制升降温循环数量间接控制重复序列拷贝数量，具有重 复序列合成拷贝数量可控，合成步骤简单等特点，十分适合工业化高通量生产。另外该合成 方法仅需要单一生物酶活性物质，且三种起始单链DNA引物需求很少，反应体系也十分微 量，对引物纯度也无任何要求(在合成过程中可使用NaCl浓度调节和校准反应效率)，从经 济效益上要远远由于现有重复序列合成方法，大大降低了制备成本，较现有方法具有明显 的成本优势。 附图说明 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中： 图1为现有技术的RCA(滚环型扩增)技术的示意图； 图2为现有技术的Gene SOE技术的示意图； 图3为本发明的基于阻断PCR的重复扩增技术(Blocking PCR based Repeat Expansion(BPRE))的示意图； 图4为根据本发明BPRE的一个具体实施方案； 图5显示本发明方法中PCR反应体系中RU、TP和BP摩尔比率对于反应的影响(图中 比率为RU：TP：BP的摩尔比)； 图6显示本发明方法中PCR反应体系中PEG分子量(A)以及PEG浓度(B)对于反应的 影响； 图7显示本发明方法中PCR反应体系中NaCl溶液浓度对于反应的影响； 图8显示本发明方法中双链重复DNA产物与升降温循环次数的关系(图中数字20、 40、70、90和120表示PCR反应中的升降温循环数)； 图9显示通过凝胶电泳法和测序法确定获得的PCR产物(双链重复DNA产物)中包括 的重复单元的拷贝数；和 图10显示通过本发明的方法获得的PCR产物(双链重复DNA产物)可用作模板，进一 步PCR扩增后并处理获得DNA亲和凝胶(A)，该DNA亲和凝胶可用作药物缓释材料(B，阿霉素 的缓释曲线)。
本发明提供一种合成包括重复单元的DNA序列的方法，所述方法包括基于所述重复单元设计和合成延伸引物和阻断引物，并且在PCR反应体系中通过使用所述重复单元(作为扩增模板)、延伸引物和阻断引物进行PCR扩增反应，获得所述包括重复单元的DNA序列。本发明还提供用于该方法 全部
背景技术：
近年来随着测序能力的提升，许多物种的基因组信息被破解，大量重复DNA序列被 陆续发现，且重复DNA序列的含量与物种进化成正相关，真核生物基因组中重复DNA序列的 种类及含量远远大于原核生物，因此预示着重复DNA元件与生物进化，复杂生物学功能直接 相关，具有非常强的生物学功能及研究意义。随着基因组学研究的深入，人们发现含有不同 拷贝数量的DNA双链序列在重结合动力学特征上存在显著区别，重复单元含量和拷贝数量 与重结合时间成负相关关系，因此根据动力学特征人们将DNA重复序列分为单拷贝重复序 列；低度重复序列；中度重复序列和高度重复序列。中度和高度重复序列元件与染色体构 建，结构维持和基因表达调整等生物学功能直接相关。另外由于中高度重复DNA分子之间具 有极强亲和自组装能力，因此中高度重复双链DNA分子往往也是极佳的生物兼容性材料的 构建基础分子。 综上所述，体外人工合成中高度重复DNA序列具有非常重要的生理学及材料学应 用价值，现有体外合成中度及高度重复DNA的方法较为有限，主要以RCA(滚环型扩增)和基 因合成拼接技术为主。 RCA技术主要借鉴病毒及原核生物质粒的环化扩增原理，通过连接酶将特定单链 DNA分子进行环化连接，获得环化DNA模板分子，然后使用与环化模板配对的单链DNA引物及 高效单链扩增酶(phi29)在等温环境下(25-37摄氏度)对环化模板进行循环复制，从而获得 与环化模板互补配对的重复单链DNA序列(如图1所示)。该方法需要经过单链模板环化；未 环单链DNA消除和环化扩增三步，操作步骤较为繁琐，且各个技术环所需生物活性酶费用较 高，严重限制了该方法的产业化，另外最终产物为单链重复DNA分子，后期改进方法MCH需要 额外添加更多的单链引物，从而获得DNA双链分子产物。RCA方法获得重复DNA分子拷贝数量 与反应时间成正相关，即只能通过控制反应时间来控制最终产物的拷贝数量，在实际操作 中产物长度难以预测性，难以精确控制产物重复序列的拷贝数量，缺乏实用性，故RCA扩增 法合成中高度重复DNA一直停止在实验室应用阶段，难以产业化。 随着高通量DNA引物合成技术的成熟，重叠区扩增基因拼接法逐渐成为基因合成 的主流(Gene SOE)。Gene SOE技术将长DNA片段分割成多级小片段，每个片段两侧存在特异 识别碱基序列，通过碱基互补原则在连接酶或扩增酶的协作下完成多级小片段的顺序组 装，最终获得长片段DNA基因序列(如图2所示)。重叠区域碱基长度及碱基配比，引物Tm值对 整个拼接效率产生至关重要的影响。然而，由于高重复DNA序列当拷贝数量达到一定阈值 时，DNA分子内部会产生碱基配对滑动及错配现象，严重影响扩增及连接效率，导致拼接效 率下降，错误率增加等问题，最终导致拼接法合成中高度重复DNA周期较长，碱基突变率高 3 CN 111575272 A 说 明 书 2/6 页 和拷贝数量难以控制等问题，最终影响重复DNA双链的合成。
技术实现要素：
为解决重复序列合成中所面临的高成本，周期长，错误率较高等问题，本发明人研 发了一种新型的体外快速合成中高度重复序列的方法。 本发明的方法是一种基于阻断PCR的重复扩增技术(Blocking PCR based Repeat Expansion(BPRE))，其基于普通的链式聚合酶扩增反应，使用三条互补配对的DNA引物序 列，在循环加热变性过程中阻断引物模板与重复单元模板实现空间位阻配对，暴露重复单 元引物3’端数个(例如6个)碱基，暴露的数个游离碱基基团与扩增引物(延伸引物)模板3’ 端互补碱基配对，形成引物二聚体形成，在扩增酶(Taq DNA聚合酶)的作用下完成二聚体的 双方向扩增，完成一个重复序列的积累延伸(如图3所示)。新生成的重复DNA双链序列再次 经历加热变性和降温复性过程，重复上述空间位阻及二聚体生成延伸过程，最终完成高度 重复DNA序列的累计增加，故该方法重复序列的累计与升降温循环数量成正相关。 因此，本发明提供以下各项： 1.一种合成包括重复单元的DNA序列的方法，所述方法包括以下步骤： 1)基于所述重复单元设计和合成延伸引物和阻断引物，其中所述阻断引物与所述 重复单元的互补序列的区别在于缺少互补序列的5’端的n个核苷酸(5’至3’方向)，所述延 伸引物与所述重复单元的互补序列的区别在于3’端增加了所述n个核苷酸(5’至3’方向)， 使得所述延伸引物和所述阻断引物两者当以5’至3’方向串联起来时正好是两个所述重复 单元的互补序列，其中n为3至20的整数，优选4至10的整数(例如4、5、6、7、8、9和10)；和 2)在PCR反应体系中，通过使用所述重复单元(作为扩增模板)、延伸引物(作为重 复单元延伸模版)和阻断引物进行PCR扩增反应，获得所述包括多个重复单元的DNA序列。在 PCR反应体系中，阻断引物首先与重复单元配对(由于所述阻断引物与所述重复单元的互补 序列的区别在于缺少互补序列的5’端的n个核苷酸(5’至3’方向)，因此重复单元的3’端的 所述n个核苷酸处于未配对状态)，然后延伸引物的3’端的所述n个核苷酸与重复单元上未 配对的核苷酸进行配对，之后进行PCR延伸扩增反应。 本发明所述的“包括多个重复单元的DNA序列”也称为重复序列。重复序列在基因 组中广泛存在，按照重复单元的排列方式，可将它分为串联重复序列和散在重复序列两大 类。串联重复序列就是重复单元首尾相连、串接在一起的重复序列。本发明的方法尤其适合 于合成串联重复序列。对于重复单元(RU)的长度没有特别限制，例如可以为3～100(例如， 20、30、40、50、60、70、80、90或100)个核苷酸，优选10～30个核苷酸，例如20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30个核苷酸。 2.根据以上1所述的方法，其还包括确定获得的DNA序列中所述重复单元的拷贝数 的步骤，优选通过凝胶电泳分析PCR产物的分子量或者通过DNA测序技术。本发明获得的DNA 序列中重复单元的拷贝数可以为2拷贝至数千拷贝，例如5-200个拷贝，例如10、20、30、40、 50、60、70、80、90和100个拷贝。 3.根据以上1所述的方法，其中在PCR反应体系中还包括PEG分子，优选其分子量为 2000～20,000Da，更优选为4,000Da、6,000Da或8,000Da，更优选其在PCR反应体系中的浓度 为4wt％至20wt％(例如4wt％，8wt％和12wt％)。 4 CN 111575272 A 说 明 书 3/6 页 4.根据以上3所述的方法，其中在PCR反应体系中还包括NaCl。在本发明的一个优 选实施方案中，使用新批次引物时测试添加不同浓度NaCl对反应产物的影响，选择最佳浓 度。优选在PCR反应体系中NaCl的使用浓度为20～80mM，优选30～60mM。 5.根据以上1所述的方法，其中在PCR反应体系中所述重复单元、延伸引物和阻断 引物的摩尔比为1:1-10:1-40，优选1:1:10。 6.根据以上1所述的方法，其中所述PCR扩增反应为两步法PCR或三步法PCR。 本发明的PCR反应体系可以通过本领域已知的任何合适的PCR方法进行PCR反应。 标准三步法PCR通常包括以下步骤： 1)DNA变性：(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA； 2)退火：(60℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链； 3)延伸：(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以dNTP为原料， 从引物的3’端开始以从5’→3’端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。 对于PCR产物的拷贝数，荧光素(溴化乙锭，EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手 段。电泳法检测法也是可用的检测方法。另外还有荧光探针检测法。 本发明优选采用两步法PCR，其与标准三步法PCR的主要区别在于： 1)步骤不同：两步法退火和延伸同时进行，以减少一次升降温过程，而三步法则分 两次完成； 2)用时不同：两步法减少一次升降温过程，提高了反应速度，用时较短。 7.根据以上1至6中任一项所述的方法，其中所述包括重复单元的DNA序列为低度 重复序列、中度重复序列或高度重复序列，优选中度重复序列或高度重复序列。 8 .一种用于合成包括重复单元的DNA序列的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应体 系，所述PCR反应体系包括用作扩增模板的所述重复单元，延伸引物和阻断引物，其中所述 阻断引物与所述重复单元的互补序列的区别在于缺少互补序列的5’端的n个核苷酸(5’至 3’方向)，所述延伸引物与所述重复单元的互补序列的区别在于3’端增加了所述n个核苷酸 (5’至3’方向)，使得所述延伸引物和所述阻断引物两者当以5’至3’方向串联起来时正好是 两个所述重复单元的互补序列，其中n为3至20的整数，优选4至10的整数(例如4、5、6、7、8、9 和10)。 9.根据以上8所述的试剂盒，其中： 1)在所述PCR反应体系中还包括PEG分子，优选其分子量为2000～20,000Da，更优 选为4,000Da、6,000Da或8,000Da，更优选其在PCR反应体系中的浓度为4wt％至20wt％(例 如4wt％，8wt％和12wt％)； 2)在所述PCR反应体系中还包括NaCl。使用新批次引物时测试添加不同浓度NaCl 对反应产物的影响，选择最佳浓度。优选NaCl在PCR反应体系中的使用浓度为20～80mM，优 选30～60mM； 3)在所述PCR反应体系中所述重复单元、延伸引物和阻断引物的摩尔比为1:1-10: 1-40，优选1:1:10；和/或 4)所述PCR反应体系中包括Taq DNA聚合酶。 10.根据以上8或9所述的试剂盒，其中所述包括重复单元的DNA序列为低度重复序 列、中度重复序列或高度重复序列，优选中度重复序列或高度重复序列。 5 CN 111575272 A 说 明 书 4/6 页 本发明的方法可以通过控制升降温循环数量间接控制重复序列拷贝数量，具有重 复序列合成拷贝数量可控，合成步骤简单等特点，十分适合工业化高通量生产。另外该合成 方法仅需要单一生物酶活性物质，且三种起始单链DNA引物需求很少，反应体系也十分微 量，对引物纯度也无任何要求(在合成过程中可使用NaCl浓度调节和校准反应效率)，从经 济效益上要远远由于现有重复序列合成方法，大大降低了制备成本，较现有方法具有明显 的成本优势。 附图说明 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中： 图1为现有技术的RCA(滚环型扩增)技术的示意图； 图2为现有技术的Gene SOE技术的示意图； 图3为本发明的基于阻断PCR的重复扩增技术(Blocking PCR based Repeat Expansion(BPRE))的示意图； 图4为根据本发明BPRE的一个具体实施方案； 图5显示本发明方法中PCR反应体系中RU、TP和BP摩尔比率对于反应的影响(图中 比率为RU：TP：BP的摩尔比)； 图6显示本发明方法中PCR反应体系中PEG分子量(A)以及PEG浓度(B)对于反应的 影响； 图7显示本发明方法中PCR反应体系中NaCl溶液浓度对于反应的影响； 图8显示本发明方法中双链重复DNA产物与升降温循环次数的关系(图中数字20、 40、70、90和120表示PCR反应中的升降温循环数)； 图9显示通过凝胶电泳法和测序法确定获得的PCR产物(双链重复DNA产物)中包括 的重复单元的拷贝数；和 图10显示通过本发明的方法获得的PCR产物(双链重复DNA产物)可用作模板，进一 步PCR扩增后并处理获得DNA亲和凝胶(A)，该DNA亲和凝胶可用作药物缓释材料(B，阿霉素 的缓释曲线)。
