技术摘要：
本发明涉及液相原位荧光杂交检测大肠杆菌O157:H7的鉴定方法、试剂盒和探针，基于核糖体rRNA的多拷贝，及受环境稳影响较小的特性，运用NCBI数据库信息和DNASTAR软件的序列比较分析的功能，结合PNA探针设计的原则，设计了具有大肠杆菌O157特异性的肽核酸探针，并将探针N  全部
背景技术：
大肠杆菌O157:H7(E.coli  O157:H7)是肠出血性大肠杆菌常见的血清型,是以食 物为主要的传播途径的致病菌，在世界范围内普遍存在，广泛分布于水、土壤和食物中，肉 类、蔬菜、水果等均可成为传染源。大肠杆菌O157：H7可产生志贺氏毒素样细胞毒素，引起严 重并发症，甚至导致死亡，死亡率可达5％～10％。近年，肠出血性大肠杆菌O157:H7感染在 世界各地都有不同规模的爆发和流行，在世界范围内都受到普遍关注。此外，E.coli  O157: H7的感染剂量极低，在食入不足10个细菌就可能引起疾病。目前还没有一种特效药或有效 的治疗手段，因此建立快速、有效的检测方法对E.coli  O157:H7的预防工作显得尤为重要。 肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全 新的DNA模拟物，其骨架结构单元为(2-氨乙基)甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接与主 骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或RNA-DNA互 补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA亲和性， 在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探 针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术(FISH)，与传统生化鉴定比较，PNA- FISH法可节约大量时间，若不计增菌时间，一般耗时不超过4个小时。与PCR等方法比较， PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性较低，且PNA- FISH法可省去核酸提取的步骤。
技术实现要素：
本发明的目的在于通过设计具大肠杆菌O157:H7特异性的PNA探针，并结合FISH检 测技术，实现对大肠杆菌O157:H7的快速准确检测。 为了实现上述发明目的，本发明提供一种用于大肠杆菌O157:H7肽核酸原位荧光 杂交鉴定的PNA探针，该探针具有如下核苷酸序列：5’-GAGCCTCTTTTATGG-3’。 基于核糖体rRNA的多拷贝，及受环境稳影响较小的特性，运用NCBI数据库信息和 DNASTAR软件的序列比较分析的功能，结合PNA探针设计的原则，设计了具有大肠杆菌O157 特异性的肽核酸探针，并将探针N端标记荧光素，与荧光原位杂交(fluorescence  in  situ  hybridization，FISH)技术结合用于检测。同时建立了液相荧光原位杂交检测方法，并优化 了杂交条件。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过3个小时；PNA-FISH 法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去 繁琐DNA提取的步骤。 在一些实施例中，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为Cy3。 3 CN 111575391 A 说　明　书 2/7 页 本发明还提供一种用于鉴定大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其包含上述所述的探针。 在一些实施方式中，所述试剂盒包括杂交液，所述杂交液pH9.0，且其包含如下组 份：20mM  Tris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml  PNA探针。 本发明另提供一种液相原位荧光杂交检测大肠杆菌O157:H7的鉴定方法，该方法 包括如下步骤： 步骤1)细菌的培养及固定：离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS 调整菌液浓度，细菌离心，弃PBS，用酒精/PBS固定缓冲液重悬，离心去上清； 步骤2)液相杂交及荧光观察：向步骤1)加入包含有权利要求1所述的探针的杂交 液，重悬；样品置于PCR管中，水浴，加入洗涤缓冲液振荡孵育，离心弃上清，第二次洗涤后孵 育；洗涤缓冲液悬至一定体积，取涂片显微镜观察。 本发明提供的液相PNA荧光原位杂交方法，在菌株液相状态时，对其进行固定(固 定后可存放于-20℃，可保存6个月)，相比较固相杂交方法而言，液相方法更加灵活，之后， 仍在液相状态时，将固定菌液和杂交缓冲液混合进行液相杂交，杂交结束进行两次洗涤，最 后涂片观察实验结果；此外，液相杂交缓冲液的成份也较少，相较于固相交缓冲液，配制更 加简便。 在一些实施方式中，所述杂交液pH9 .0，且其包含如下组份：20mM  Tris， 100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml  PNA探针。 在一些实施方式中，洗涤缓冲液的pH9 .0，且其包含如下组份：10mM  Tris，1mM  EDTA。 在一些实施方式中，PBS包含如下组份：7mM  Na2HPO4、7mM  NaH2PO4、130mM  NaCl。 在一些实施方式中，该方法具体包括如下步骤： 步骤1)细菌的培养及固定： 将大肠杆菌O157:H7于BHI中37℃培养至对数生长期(约9小时)，收集细菌离心 8000g×5min，弃培养液，并用PBS洗涤一次。细菌离心8000g/5min，弃PBS，用50％酒精/PBS 固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在107～108个/ml，室温固定1小时后置于-20℃可保存6个 月； 步骤1)液相杂交及荧光观察： 取100μl固定好的菌体8000g离心5min，弃上清；加入50μl含300pmole/mlPNA探针 的杂交缓冲液(室温)重悬；样品于薄壁PCR管中，55℃水浴1.5小时；8000g离心5min，弃杂交 缓冲液；加入100μl洗涤缓冲液(预热至55℃)，55℃水浴10min；8000g离心5min，弃洗涤缓冲 液，重复洗涤一次20min；取25～30μl洗涤缓冲液重悬，取10μl菌液涂片观察荧光。 在一些实施例中，选取25株具有代表性的革兰氏阴性细菌和阳性细菌菌株，分别 为3株大肠杆菌O157:H7、5株大肠埃希氏菌(非O157)、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、亚利 桑那沙门氏菌、鸭沙门沙门氏菌、克罗诺杆菌属、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、 溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、肺炎克雷伯氏菌、宋氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、 嗜水气单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、粪肠球菌各1株。试验方法如上实施例2所述的所述 操作流程。结果显示只有阳性对照探针BacUni与所有细菌都能结合，而探针O157-23S-1不 能与这些非目标菌株结合(表2)；O157-23S-1有很好的特异性。 核糖体RNA及相关基因广泛地适用于生物进化和生物分子标记等领域，其具有如 4 CN 111575391 A 说　明　书 3/7 页 下优点：(1)在生物细胞中大量存在，对蛋白质合成是必需的，其生物合成正比于细胞生长 速度；(2)这些基因容易分离和鉴定；(3)在初级结构和次级结构中同时具有高度保守区和 可变区域；(4)目前已建立了大量rRNA的基因序列数据库，这对基因序列的比较分析十分有 用；(5)与已发现的其他基因比较，不会表现出水平基因的转移。综上，本发明针对病原微生 物的分子化石——rRNA的序列来设计PNA探针，利用该PNA探针结合FISH的方法来鉴定微生 物。 由于PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性、及其良好的细胞穿 透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检 测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。 本发明用优化后的液相PNA荧光原位杂交方法用通用探针BacUni和本发明提供的 探针对大肠杆菌O157:H7菌株进行杂交实验，结果如图1(大肠杆菌O157:H7(E.coli  O157: H7)杂交图片)所示，可以看到本发明提供的探针O157-23S-1显现出更为优越强烈的杂交荧 光信号。 进一步地，本发明相较于通用的探针显现出更为优越的特异性； 附图说明 图1为大肠杆菌O157:H7(E.coli  O157:H7)杂交图片，BacUni(A)；E.coli  O157- 23S-1(B)。