技术摘要：
本发明公开了一种委陵菜酸的提取方法及其应用。取方法包括以下步骤：1)以委陵菜全草为原料，先用乙醇溶液提取，提取液浓缩后，依次用石油醚、三氯甲烷室温萃取，去掉石油醚、三氯甲烷馏分后，再用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯，浓缩至膏状，干燥得到粗提物；2)粗 全部
背景技术：
肝纤维化(liver fibroisis)是多种原因引起的慢性肝损伤所致的病理改变，其 特征为 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内过度沉积，是肝硬化的早期可逆 阶段。有 多项研究证实，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活在肝纤维化 发展过程 中起关键作用，是肝内ECM的主要细胞来源。抑制HSCs活化、增殖与减少ECM合成 是目前阻 断、逆转肝纤维化的重要策略。 在中药领域，中药材委陵菜为蔷薇科植物委陵菜(Potentillachinensis Ser.)的 干燥 全草，其味苦，性寒，归肝、大肠经，清热解毒，凉血止痢，常用于赤痢腹痛、久痢不止、 痔疮出血、痈肿疮毒等。委陵菜酸(Tormentic acid)是从委陵菜全草中分离得到一个活性 成分。如何从委陵菜中提取高纯度的委陵菜酸是研究委陵菜酸，尤其是将委陵菜酸应用于 治 疗肝纤维化等疾病的关键之一。
技术实现要素：
本发明的第一目的是提供一种委陵菜酸的提取方法。 所述提取方法包括以下步骤： 1)以委陵菜全草为原料，先用乙醇溶液提取，提取液浓缩后，依次用石油醚、三氯 甲烷 室温萃取，去掉石油醚、三氯甲烷馏分后，再用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯， 浓缩 至膏状，干燥得到粗提物； 2)粗提物先上硅胶色谱柱进行洗脱，流动相为三氯甲烷、甲醇和水的混合物，三者 的体 积比为60:35:5；洗脱液回收有机溶剂后，先经第一次制备型HPLC收集含委陵菜酸的 馏分， 然后经Sephadex LH-20柱层析，最后经第二次制备型HPLC收集含委陵菜酸的馏分； 层析和 两次HPLC的流动相均为甲醇溶液，并且在洗脱后回收甲醇，最后所得洗脱物即为产 品。 步骤1)中： 所述委陵菜全草选用干燥全草，提取前最好先粉碎后过20目筛。 所述乙醇溶液提取的过程为：用原料重量5倍量的95％乙醇室温浸泡2小时，然后 加热 回流提取3次，每次2小时，合并3次的乙醇提取液，真空回收乙醇，得到提取液。 所述提取液减压浓缩至比重为1:1。 所述石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯的用量均为萃取混合物重量的5倍量。 所述浓缩方式优选为减压浓缩。 整个步骤的目的为粗提，先用95％乙醇室温浸泡可以药材充分吸收乙醇，使之更 容易提 出有效成分；用石油醚、三氯甲烷萃取，可以除去脂溶性高的成分，提高分离纯度； 用正交 实验证明用5倍量乙酸乙酯进行萃取，在保证比较高的提取效率之外，还可以节省 3 CN 111548386 A 说 明 书 2/6 页 乙酸乙酯 的用量，综合效果好。 步骤2)中： 所述硅胶色谱柱的规格为200-300目、10×300cm；所述HPLC选用C18柱。 所述层析所用的甲醇溶液中甲醇和水的体积比为50:50，两次HPLC所用的甲醇溶 液中甲 醇和水的体积比为55:45。 所述硅胶色谱柱洗脱和层析后，洗脱液分量(最好为500ml)为若干馏分后经过制 备型 HPLC，经过检测和收集与标准品保留时间一样的馏分，以实现收集含委陵菜酸的馏分 的目的。 整个步骤的目的为纯化，硅胶色谱柱层析中用CHCl3-MeOH-H2O洗脱，得到初提物中 委陵 菜酸的纯度较高；Sephadex LH-20柱层析(甲醇/水＝50:50洗脱)和HPLC(甲醇/水＝ 55:45 洗脱)进一步制备分离，可以得到高纯度的委陵菜酸(>97.54％)。 本发明的第二目的是提供委陵菜酸在医药领域中的应用。 其一为，委陵菜酸在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。 其二为，委陵菜酸在制备抑制肝星状细胞增殖药中的应用。 其三为，委陵菜酸在制备促进肝星状细胞凋亡药中的应用。 其四为，委陵菜酸在制备抑制PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路的药物中的应用。 本发明从委陵菜中分离出单体化合物委陵菜酸，提取方法简单易控，能够获得高 纯度的 产品。本发明还能证明委陵菜酸能明显抑制肝星状细胞的增殖、迁移和集落形成， 促进HSCs 凋亡，减少活化HSCs内胶原的生成和过度沉积，其机制可能与抑制PI3K/Akt/ mTOR和NF-κ B信号通路有关，为治疗肝纤维化提供了一种新的有效抑制肝星状细胞活化的 中药单体。
本发明公开了一种委陵菜酸的提取方法及其应用。取方法包括以下步骤：1)以委陵菜全草为原料，先用乙醇溶液提取，提取液浓缩后，依次用石油醚、三氯甲烷室温萃取，去掉石油醚、三氯甲烷馏分后，再用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯，浓缩至膏状，干燥得到粗提物；2)粗 全部
背景技术：
肝纤维化(liver fibroisis)是多种原因引起的慢性肝损伤所致的病理改变，其 特征为 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内过度沉积，是肝硬化的早期可逆 阶段。有 多项研究证实，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活在肝纤维化 发展过程 中起关键作用，是肝内ECM的主要细胞来源。抑制HSCs活化、增殖与减少ECM合成 是目前阻 断、逆转肝纤维化的重要策略。 在中药领域，中药材委陵菜为蔷薇科植物委陵菜(Potentillachinensis Ser.)的 干燥 全草，其味苦，性寒，归肝、大肠经，清热解毒，凉血止痢，常用于赤痢腹痛、久痢不止、 痔疮出血、痈肿疮毒等。委陵菜酸(Tormentic acid)是从委陵菜全草中分离得到一个活性 成分。如何从委陵菜中提取高纯度的委陵菜酸是研究委陵菜酸，尤其是将委陵菜酸应用于 治 疗肝纤维化等疾病的关键之一。
技术实现要素：
本发明的第一目的是提供一种委陵菜酸的提取方法。 所述提取方法包括以下步骤： 1)以委陵菜全草为原料，先用乙醇溶液提取，提取液浓缩后，依次用石油醚、三氯 甲烷 室温萃取，去掉石油醚、三氯甲烷馏分后，再用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯， 浓缩 至膏状，干燥得到粗提物； 2)粗提物先上硅胶色谱柱进行洗脱，流动相为三氯甲烷、甲醇和水的混合物，三者 的体 积比为60:35:5；洗脱液回收有机溶剂后，先经第一次制备型HPLC收集含委陵菜酸的 馏分， 然后经Sephadex LH-20柱层析，最后经第二次制备型HPLC收集含委陵菜酸的馏分； 层析和 两次HPLC的流动相均为甲醇溶液，并且在洗脱后回收甲醇，最后所得洗脱物即为产 品。 步骤1)中： 所述委陵菜全草选用干燥全草，提取前最好先粉碎后过20目筛。 所述乙醇溶液提取的过程为：用原料重量5倍量的95％乙醇室温浸泡2小时，然后 加热 回流提取3次，每次2小时，合并3次的乙醇提取液，真空回收乙醇，得到提取液。 所述提取液减压浓缩至比重为1:1。 所述石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯的用量均为萃取混合物重量的5倍量。 所述浓缩方式优选为减压浓缩。 整个步骤的目的为粗提，先用95％乙醇室温浸泡可以药材充分吸收乙醇，使之更 容易提 出有效成分；用石油醚、三氯甲烷萃取，可以除去脂溶性高的成分，提高分离纯度； 用正交 实验证明用5倍量乙酸乙酯进行萃取，在保证比较高的提取效率之外，还可以节省 3 CN 111548386 A 说 明 书 2/6 页 乙酸乙酯 的用量，综合效果好。 步骤2)中： 所述硅胶色谱柱的规格为200-300目、10×300cm；所述HPLC选用C18柱。 所述层析所用的甲醇溶液中甲醇和水的体积比为50:50，两次HPLC所用的甲醇溶 液中甲 醇和水的体积比为55:45。 所述硅胶色谱柱洗脱和层析后，洗脱液分量(最好为500ml)为若干馏分后经过制 备型 HPLC，经过检测和收集与标准品保留时间一样的馏分，以实现收集含委陵菜酸的馏分 的目的。 整个步骤的目的为纯化，硅胶色谱柱层析中用CHCl3-MeOH-H2O洗脱，得到初提物中 委陵 菜酸的纯度较高；Sephadex LH-20柱层析(甲醇/水＝50:50洗脱)和HPLC(甲醇/水＝ 55:45 洗脱)进一步制备分离，可以得到高纯度的委陵菜酸(>97.54％)。 本发明的第二目的是提供委陵菜酸在医药领域中的应用。 其一为，委陵菜酸在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。 其二为，委陵菜酸在制备抑制肝星状细胞增殖药中的应用。 其三为，委陵菜酸在制备促进肝星状细胞凋亡药中的应用。 其四为，委陵菜酸在制备抑制PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路的药物中的应用。 本发明从委陵菜中分离出单体化合物委陵菜酸，提取方法简单易控，能够获得高 纯度的 产品。本发明还能证明委陵菜酸能明显抑制肝星状细胞的增殖、迁移和集落形成， 促进HSCs 凋亡，减少活化HSCs内胶原的生成和过度沉积，其机制可能与抑制PI3K/Akt/ mTOR和NF-κ B信号通路有关，为治疗肝纤维化提供了一种新的有效抑制肝星状细胞活化的 中药单体。
