技术摘要：
本发明公开了一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒及其应用，该试剂盒包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、PBST、封闭液、底物液和终止液。本发明通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组牛支原体假定膜蛋白，以此作为包被抗原，建立了特异性强、  全部
背景技术：
牛支原体（Mycoplasma  bovis）是一种能引起牛呼吸综合征、乳房炎、母牛流产、关 节炎、角膜结膜炎等疾病，基因组大小约为1  080  kb，环状双股DNA、介于病毒与细菌之间且 能通过滤膜为0.22 μm的孔径的原核生物。自20世纪60年代美国分离到第一株牛支原体以 来，相继有多国报道该病原的发现，已引起全世界范围内的广泛关注。随着牛贸易以及交通 压力等因素可导致牛支原体呈广泛流行趋势，给养牛业带来巨大的经济损失，英国每年死 于肺炎的犊牛约有15.7万头，其中约有2.5亿~3.3亿英镑的经济损失是由牛支原体引起的； 美国每年由于感染该病而造成的经济损失高达3  200万美元。我国于2008年报道牛支原体 肺炎疫情，随后，广西、湖北、甘肃、重庆、内蒙古、贵州、宁夏、新疆等地均有该病的报道。该 病的发病率为50%~100%，病死率为20%~50%，给我国养牛业造成了严重的危害。因此，快速准 确检出牛支原体感染情况，对养牛业健康发展具有非常重要的意义。 目前国内外对牛支原体的诊断方法主要有病原的分离鉴定、PCR检测技术和血清 学诊断等方法。由于牛支原体的特殊结构，牛支原体培养的条件要求非常苛刻，而且牛支原 体的生化特性与无乳支原体的生化特性基本一致，因此，给牛支原体的鉴别诊断带了困难。 PCR技术具有快速、特异、敏感等优点，是目前牛支原体检测的主要方法，适用于感染或潜伏 期排毒的牛群，主要用以检测肺脏组织、鼻拭子、纯化产物等病料。检测牛支原体的血清学 方法主要有间接血凝试验、补体结合试验、生长抑制试验、琼扩试验、被动颗粒凝集试验以 及酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，其中ELISA是最主要的牛支原体血清学检测方法。本 研究利用分子生物信息学方法从牛支原体分离株BS2上选择假定膜蛋白进行原核表达，筛 选出具有较好地免疫厡性蛋白，并以此作为包被抗原，建立牛支原体间接ELISA检测方法， 该方法为大批量检测样品提供技术支持，为今后牛支原体的临床诊断和综合防控提供重要 依据。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种用于牛支原体抗体检测试剂盒，有助于牛支 原体抗体监测和免疫评估。 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案： 一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标 准血清、酶标二抗、PBST、封闭液、底物液和终止液； 所述的包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释获得； 所述包被抗原是通过应用生物信息学的方法筛选目的基因，再通过构建表达载体获得 免疫原性较强的重组牛支原体假定膜蛋白，该蛋白序列如SEQ.ID.No.1所示。 3 CN 111579793 A 说　明　书 2/7 页 优选地，所述包被液为pH  9.6的碳酸盐缓冲液，由Na2CO3和NaHCO3组成。 优选地，所述的封闭液为5%脱脂奶粉。 优选地，所述阴性标准血清是牛支原体抗体阴性的牛血清；所述阳性标准血清是 牛支原体抗体阳性的牛血清。 优选地，所述酶标二抗是HRP标记兔抗牛-IgG。 优选地，所述PBST由NaCl，KH2PO4，  KCl，Na2HPO4·12H2O，Tween-20 组成。 优选地，所述底物液是TMB  显色液，所述终止液由浓硫酸和蒸馏水组成。 本发明还提供一种用于牛支原体抗体检测的ELISA试剂盒的应用，按照以下步骤 进行： （1）抗原获得：通过构建表达载体获得免疫原性较强的重组牛支原体假定膜蛋白，以此 作为包被抗原； （2）包被孵育：将重组蛋白按1:80倍稀释按200 μL/孔包被到酶标板孔，孵育一定时间 后移除上清液； （3）封闭：按200 μL/孔加入封闭液，一定时间后移除孔内液体，按200 μL/孔添加 PBST，静止后移除孔内液体，重复洗涤数次后拍干； （4）加样：对封闭后的板依次血清和二抗，之后加底物显色液； （5）终止反应：按50 μL/孔加入终止液，在酶标仪上测定OD450值，并记录结果； （6）判定结果：样品OD450值大于或等于临界值为阳性。 优选地，所述判定结果是样品OD450值大于或等于临界值0.389为阳性，小于临界 值0.389为阴性。 本发明的有益效果为： 针对目前牛支原体缺乏简便有效检测手段的问题，通过构建表达载体获得免疫原性较 强的牛支原体假定膜蛋白重组蛋白，以此作为包被抗原，建立了特异性强、灵敏度高的牛支 原体抗体ELISA检测方法，将该试剂盒用于牛血清检测，将有助于基层工作人员及时了解牛 支原体免疫或感染动态，为牛支原体防控制定有效措施。 附图说明 图  1是牛支原体假定膜蛋白基因扩增结果。图中：M：DNA  marker；1：目的基因；2： 阴性对照。 图2是不同质粒pET-32a-BS2转化菌株的诱导表达SDS-PAGE电泳结果，图中：M：蛋 白质标准Marker；1：空白对照；  2-5：重组菌株的诱导产物。 图3是Western  blot  检测结果，图中：M：蛋白质标准Marker；1：空载体对照；2：牛 支原体假定膜蛋白。