技术摘要：
本发明公开了一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒，所述的试剂盒包含分别与各检测基因对应的多个叠瓦式寡核苷酸探针，用于获取所述检测基因的热点突变区域的变异信息；所述检测基因包括48个检测基因。本发明还公开了采用免疫磁珠分选细胞结合高通量测序技术检测能提高  全部
背景技术：
目前已知的血液肿瘤就包括了40多种白血病、50多种淋巴瘤和多种骨髓瘤。多发 性骨髓瘤是浆细胞异常增生的恶性肿瘤，是一种目前还无法治愈的血液恶性肿瘤。多发性 骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞克隆增殖性疾病，正常的浆细胞负责生成对抗感染的抗体 (免疫球蛋白)，骨髓中发生癌变的浆细胞称为骨髓瘤细胞，它在骨髓中大量增殖聚集，替代 了骨髓中正常的细胞，破坏正常的免疫系统，并抑制正常的造血功能，进一步损伤骨骼及软 组织(神经和肌肉等)等的功能。多发性骨髓瘤在全球发病率各不相同，在美国，多发性骨髓 瘤是继非霍奇金淋巴瘤的血液系统第二大恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的1％，占血液系统 恶性肿瘤的13％。在中国，多发性骨髓瘤发病率约为1/10万～2/10万，已经超过急性白血 病，位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。 随着对多发性骨髓瘤发病机制研究的不断深入、诊断标准和预后评估方式的更 新、新药的不断问世，以及异基因造血干细胞移植供者来源问题的解决，MM患者的治疗效果 已经明显得到改善。近几年来，国内多发性骨髓瘤诊疗水平也取得了长足进步，逐渐与国际 水平接轨。NCCN、ESMO、中国多发性骨髓瘤诊治指南中明确指出关于多发性骨髓瘤的诊断分 型、鉴别诊断、治疗及复发治疗。数据库中权威文献报道与多发性骨髓瘤相关基因突变的预 后影响，其中包括预后良好的基因(IRF4、EGR1等)突变，预后不良的基因(TP53、ATM、ATR、 ZFHX4等)突变，这些基因的变异情况均可作为MM患者预后分子标记物。 高通量测序技术(NGS)出现以来，血液肿瘤受相关基因突变影响尤为明显。最常见 的基因涉及MAPK通路、NF-kB通路、DNA损伤应答/TP53通路。迄今为止的实验证据表明，多发 性骨髓瘤的进展，无论是无症状期的自发进展还是治疗后的复发，都与其异质性克隆及亚 克隆成分有关。新发的多发性骨髓瘤(MM)突变谱具有高度异质性，只有少数基因突变在多 发性骨髓瘤患者中反复出现，而<10％的患者中同时存在多个的基因突变，在同一患者中， 基因突变通常只存在于一小部分细胞中，因此，我们需要将这一小部分细胞先富集纯化做 预处理，再从预处理后的细胞中提取核酸进行高通量测序。这样，预处理和复发多发性骨髓 瘤患者样本中，亚克隆结构的基因突变检测频率更高。 目前，我们仍然主要依靠形态学特征和有限的免疫表型来识别克隆浆细胞，浆细 胞疾病的范围从无症状的浆细胞单克隆群到浆细胞白血病和多发性骨髓瘤，其中骨髓中的 正常细胞可以被骨髓瘤浆细胞积累所取代。免疫磁珠分选细胞已成为一种宝贵的工具，根 据多发性骨髓瘤患者CD138 的强表达，浆细胞可以从其他白细胞中分离出来。本发明中涉 及了采用免疫磁珠分选法从新鲜或冷冻的人骨髓单核细胞中分离高纯度CD138 细胞，通过 识别CD138表面标记物的抗体靶向CD138 细胞进行阳性选择，相比流式细胞仪分选的复杂 操作，此方法具有温和、快速简单、高纯度的优势。 3 CN 111575375 A 说　明　书 2/17 页 基于富集CD138 细胞的基础上，对富集后CD138 细胞进行核酸提取，设计一系列 的叠瓦式寡核苷酸探针，探针覆盖区域为与多发性骨髓瘤相关的48种基因编码区，通过探 针与基因组DNA片段进行杂交实现对特定基因组区域的富集，随后通过NGS技术对该区域进 行深度测序，发现目标区域的特定变异信息。鉴于市场上与多发性骨髓瘤相关基因检测大 多是对全血细胞中提取的核酸DNA进行高通量深度测序，由于多发性骨髓瘤基因突变通常 只存在于一小部分细胞中，我们需要将这一小部分细胞先富集，可以避免在多发性骨髓瘤 中漏检基因变异的情况。 本发明涉及数据库文献中报道与多发性骨髓瘤相关的48种基因的检测，按基因功 能分类主要分为：信号传导通路基因，如ATM、BIRC、BRAF、CARD11、EGFR、KIT、CXCR4、PTPN11 及KRAS等；免疫途径基因，如B2M；细胞周期调节基因：CCND1、CDKN1B；抑癌基因，如WT1、 TP53、CDKN2A；转录因子基因，如CUX1、IKZF1、PHF6、RB1等；甲基化基因，如IDH1、IDH2、TET2 等；原癌基因，如MYC；染色质修饰基因，如KDM6A。
技术实现要素：
本发明的目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种多发性骨髓瘤基因突变检 测试剂盒和检测方法，以此解决现有的基因突变检测技术中，漏检基因变异的情况。本试剂 盒通过温和、高效、快速、简单的方法对多发性骨髓瘤患者浆细胞中CD138 细胞进行富集， 对富集后的CD138 细胞进行文库构建结合高通量测序技术检测基因突变。 本发明提供了一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒，所述的试剂盒包含分别与 各检测基因对应的多个叠瓦式寡核苷酸探针，用于获取所述检测基因的热点突变区域的变 异信息；所述检测基因包括48个检测基因：ATM、B2M、BIRC3、BRAF、CARD11、CCND1、CDKN1B、 CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、DIS3、DNM2、EGFR、FAM46C、FAT1、FGFR3、FLT3、IDH1、IDH2、 IKZF1、IL7R、IRF4、JAK1、JAK2、KDM6A、KIT、KRAS、MYC、MYD88、NF1、NRAS、PDGFRB、PHF6、 PIK3CA、PRDM1、PRPF40B、PTPN11、RB1、RELN、SF3B1、STAT3、SUZ12、TET2、TP53、TRAF3、WHSC1、 WT1。 在本发明的一些实施方案中，所述叠瓦式寡核苷酸探针对应的其中8个检测基因 的热点突变位点如下所示： 4 CN 111575375 A 说　明　书 3/17 页 本发明还提供了一种多发性骨髓瘤基因突变检测方法，利用本发明提供的试剂盒 可以温和、高效、快速检测多发性骨髓瘤基因突变，并且所述的检测方法包括以下步骤： S1 .裂解红细胞以获取白细胞：采集骨髓血液，使用红细胞裂解液裂解红细胞，经 离心分离，获取纯的白细胞； S2.筛选CD138 细胞：采用免疫磁珠分选出CD138 细胞； S3.提取待测样本基因组DNA：利用天根DNA提取试剂盒对分选后的CD138 细胞进 行抽提DNA，通过质检确保DNA浓度达10ng/ul以上； S4.文库构建：使用超声破碎仪将基因组DNA随机打断成150bp～250bp的片段经末 端修复、3’端加特异性的A尾、引入测序接头、纯化、PCR扩增构建文库； S5.文库捕获及上机测序：使用试剂盒中叠瓦式寡核苷酸探针捕获48种基因特定 外显子区域，通过高通量测序illumina平台的Novaseq  6000进行测序以获取48种基因特定 区域的变异信息。 在本发明的一些实施方案中，步骤S1中，所述红细胞裂解液分两次加入，所述离心 次数为两次，第一次离心条件为：冰浴10min后2100rpm离心10min；第二次离心条件为颠倒 混匀震荡30s后2000rpm离心5min。 在本发明的一些实施方案中，步骤S3中，利用Nano及Qubit定量检测DNA的OD值及 浓度。 在本发明的一些实施方案中，步骤S3中，通过凝胶电泳检测DNA的完整性，其中电 泳条带应无明显拖尾。 本发明的目的之一是提供一种多发性骨髓瘤(MM)中权威数据库报道的48种具有 明确临床意义的基因突变的检测方法，该48个基因分别为：ATM、B2M、BIRC3、BRAF、CARD11、 CCND1、CDKN1B、CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、DIS3、DNM2、EGFR、FAM46C、FAT1、FGFR3、FLT3、 IDH1、IDH2、IKZF1、IL7R、IRF4、JAK1、JAK2、KDM6A、KIT、KRAS、MYC、MYD88、NF1、NRAS、PDGFRB、 PHF6、PIK3CA、PRDM1、PRPF40B、PTPN11、RB1、RELN、SF3B1、STAT3、SUZ12、TET2、TP53、TRAF3、 WHSC1、WT1。 所检测的部分基因经过COSMIC数据库、ClinVar数据库及权威文献中的报道，具体 5 CN 111575375 A 说　明　书 4/17 页 相关报道及临床意义如下： CCND1基因位于11号染色体，有5个外显子，其编码的蛋白属于高保守的细胞周期 蛋白家族，与肿瘤抑制蛋白Rb相关，表达受Rb蛋白调控；CCND1基因的突变、扩增和过表达常 出现在多种肿瘤细胞中。CCND1基因与未突变的t(11，14)骨髓瘤患者相比发生CCND1基因 V42L突变的患者总生存期OS降低，在骨髓瘤患者中存在CCND1基因P18S突变。 CXCR4位于2号染色体长臂，共有2个外显子，其编码蛋白是一种趋化因子受体。在 生理状态下，CXCR4在胚胎发生时期对淋巴细胞生成和骨髓成髓作用有重要作用；个体出生 以后，可通过CXCR4/SDF-1的相互作用调控CD34 细胞归巢到骨髓，同时在淋巴细胞转运过 程中发挥作用。 CUX1基因位于7号染色体，由34个外显子组成，CUX1基因编码的蛋白属于DNA结合 同源结构域家族，或许可以调控基因表达、形态发生与分化，可能还在细胞周期中发挥作 用。 BRAF基因位于7号染色体，有21个外显子，是RAF激酶家族中的主要成员，BRAF基因 突变使BRAF激酶持续活化，激活下游MAPK和MEK-ERK等信号通路，进而促进细胞增殖和肿瘤 侵袭转移，导致肿瘤细胞无限生长。 KRAS基因位于12号染色体，有6个外显子，属于原癌基因RAS家族，其编码的蛋白通 过结合多种细胞膜受体调节信号转导，在细胞增殖、分化、凋亡等多种生理过程中发挥重要 作用。 RB1基因位于13号染色体，由28个外显子组成，具有明显的细胞转化抑制作用，在 许多肿瘤中出现RB1基因的突变或缺失。 TRAF3基因位于14号染色体，有15个外显子，是肿瘤坏死因子受体作用因子(TNF  receptor  associatedfactors，TRAFs)家族成员之一，主要参与TNF受体家族信号通路；多 篇研究发现TRAF3的缺失能够导致非经典NF-kB信号通路激活，影响血液病的发生发展。 本发明的另一个目的在于提供一种温和、高效、快速、简单的CD138 细胞富集方法 及试剂盒。在本发明的另外一个方面，本发明采用免疫磁珠分选细胞结合高通量测序技术 检测能提高多发性骨髓瘤基因突变的检出率，免疫磁珠细胞分选是高效简捷的CD138 细胞 分离纯化方法，富集处理后的细胞在多发性骨髓瘤患者样本中亚克隆结构的基因突变检测 频率更高，可有效避免在多发性骨髓瘤中低频比例的基因突变漏检情况，在多发性骨髓瘤 的诊断、治疗以及微小残留病灶(MRD)监测应用中具有广泛的临床价值。 本发明的另一个目的在于对MM患者CD138 细胞富集后的核酸提取，进行下游的文 库构建，采用高通量测序技术进行测序，来分析MM患者的基因变异情况。 本发明的另一个目的在于对分选后的CD138 细胞进行核酸(DNA)提取，提取试剂 盒购买于天根生化，提取所得的核酸(DNA)质检标准：Nano所测OD260/280值应在1.8～2.0 之间，浓度的Q/N值大于0.6，Qubit定量浓度大于10ng/ul；核酸(DNA)的质量会对下游的建 库有很大影响，DNA浓度及纯度不达要求可能会引起建库失败或扩增效率受到抑制，致使最 终的检测结果不准确。因此，MM患者浆细胞中CD138 细胞的富集是前提，DNA的提取质量是 保证结果的条件之一。 本发明的另一个目的在于对提取后核酸DNA质检合格，用于下游高通量测序文库 的构建。根据所检测48种基因特定基因组区域的设计探针，通过探针与基因组DNA片段进行 6 CN 111575375 A 说　明　书 5/17 页 杂交实现对特定基因组区域的富集，随后通过NGS技术对该区域进行深度测序，发现目标区 域的特定变异信息。建库过程中普通扩增选用的PCR仪为BIO-RAD  T100，测序所选用的是高 通量测序illumina平台的Novaseq  6000进行测序，采用的测序策略为PE150，故文库片段大 小集中在250～400bp。 附图说明 图1示出了本发明中的免疫磁珠分选细胞技术原理图； 图2示出了本发明中二代测序检测技术的文库检测结果图。