技术摘要：
本发明属于代谢组学技术领域，涉及一种基于UPLC/HRMS的代谢组学相对定量分析方法。具体而言，该方法主要包括同位素内标混合溶液、标准曲线校正溶液和代谢组学样本溶液的配制，获取标准曲线校正溶液和代谢组学样本溶液的原始质谱数据，对原始数据进行转置和解卷积，鉴定  全部
背景技术：
代谢组学(Metabolomics)研究生物体系受外源性物质刺激、环境变化或遗传修饰 等因素影响后产生的所有代谢应答，并检测代谢应答的全貌及其动态变化，研究对象一般 为相对分子质量小于1000的小分子代谢物，以高通量、大规模实验方法结合模式识别、专家 系统等计算体系为特征，对生物体内所有代谢物进行定性定量分析，是系统生物学的重要 组成部分。 根据研究目的不同，代谢组学可以分为四个层次：代谢物靶标分析(metabolite  target  analysis)、代谢轮廓分析(metabolic  profiling  analysis)、代谢指纹分析 (metabolic  fingerprint  analysis)和代谢组学研究(metabonomics)，其中代谢物靶标分 析和代谢轮廓分析用于定量检测某个或某类特征性代谢物，代谢指纹分析用于定性或半定 量分析全部代谢物，代谢组学研究则用于定量分析全部代谢物，但最后一个层次目前尚未 能实现。 鉴于代谢组学的研究方法主要是对代谢物进行定性定量分析，其检测手段则以化 学分析领域当下的主流技术为主，包括核磁共振(NMR)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)、超 高效液相色谱(UPLC)等。核磁检测技术的优点是样品无需繁琐的前处理，可以实现样品无 创性和代谢物种类无偏向性检测，而缺点是相比于质谱检测技术的灵敏度较低，动态范围 有限，对含量较低或浓度相差较大的物质难以同时测定；另外，核磁检测技术目前偏向于定 性研究，适合于鉴定未知代谢物。而质谱检测技术则具有较高的检测灵敏度，与色谱技术联 用后更可以将复杂样本中的代谢物先进行色谱分离再进行质谱检测，减少了基质的干扰， 有利于痕量代谢物的检测。 质谱检测技术依赖于代谢物在离子源中发生电离后生成的不同质荷比的带电荷 离子，在质量分析器中实现分离和聚焦，从而获得质谱图。根据联用的色谱仪器不同，色谱 质谱联用技术可以分为气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)和毛细管 电泳-质谱联用(CE-MS)等。气相色谱-质谱联用技术适合于分析极性小、易挥发和热稳定性 较好的代谢物，针对挥发性较低的代谢物需要衍生化预处理，而衍生化过程受水分因素影 响较大，且很难反映代谢物在生物样本中真实情况。液相色谱-质谱联用技术适合于分析中 等或大极性、中低挥发性或非挥发性和热稳定性较差的代谢物。而根据质谱检测器不同，又 可以分为四极杆检测器(单四极杆和三重四极杆)和高分辨率检测器(飞行时间/TOF、轨道 离子阱/Orbitrap和傅里叶变换离子回旋共振/FTICR)，其中四极杆质谱适合代谢物的定量 检测，高分辨率质谱适合代谢物的定性分析。由于质谱检测技术对于代谢物的化学性质具 有明显的偏向性，因此难以利用单独一种检测手段来同时完成定性和定量，需要多平台互 补分析才能较为全面地考察代谢物的变化概况。 4 CN 111579665 A 说　明　书 2/12 页 由于存在上述技术缺陷，目前只能围绕某单一平台开展定性或定量代谢组学检测 方法。例如应用GC-MS平台来检测生物样本中的脂肪酸等，利用LC-MS/MS平台来开发靶向代 谢物(包括胆汁酸、氨基酸和神经递质等)检测方法，采用高分辨质谱平台来鉴别代谢物的 结构。因此，对生物样品中的代谢物进行全面、高通量、高灵敏度的同时定性定量分析仍是 代谢组学研究亟需攻克的难点。 中国发明专利申请CN104297355A公开了一种基于液相色谱/质谱联用的拟靶标代 谢组学分析方法，但该方法仍然需借助两种质谱平台(Q-TOF和QQQ)的基础上进行相对定量 分析，浓度分析结果以当批次的质控血清(QC)经校正计算所得。Chen等公开了一种数据依 赖的靶向定量代谢组学检测方法(DITQM)，但该方法也是基于定性或定量两种质谱设备，首 先通过高分辨率质谱获取代谢物的离子对信息，再通过三重四极杆质谱录入这些离子对， 以当批次的质控血清(QC)作为校正物质来计算代谢物相对定量浓度(参见Chen  Y .,Zhou  Z .,Yang  W .,et  al .,Development  of  a  data-independent  targeted  metabolomics  method  for  relative  quantification  using  liquid  chromatography  coupled  with  tandem  mass  spectrometry[J],Anal.Chem.,2017,89(13):6954-6962)。尽管上述两种检 测方法在一定程度上解决了定性和定量的问题，但仍需要同时使用两种质谱平台，而且均 以各自实验室的质控血清(QC)样本作为计算浓度的定量校正样本，导致各实验室测得的浓 度结果相互独立，无法兼容。尤其重要的是，上述采用的方法未对代谢物或差异代谢物进行 结构鉴定(或注释)，并不清楚是何种代谢物发生浓度变化，因而对代谢组学研究的意义不 大，未从根本上解决代谢组学的同时定性和定量技术问题。
技术实现要素：
发明要解决的问题 针对上述技术问题，本发明的目的在于建立一种能够基于一个平台对代谢组学样 本实现同时定性和相对定量分析的方法。 用于解决问题的方案 本发明提供了一种基于UPLC/HRMS的代谢组学相对定量分析方法，其包括下列步 骤： 1)基于多种同位素内标，配制同位素内标混合溶液； 2)基于代谢组学样本，确定与之匹配的相对定量校正样本，并利用所述相对定量 校正样本和步骤1)中所述同位素内标混合溶液，配制一系列浓度梯度的相对定量标准曲线 校正溶液； 3)利用步骤2)中所述代谢组学样本和步骤1)中所述同位素内标混合溶液，配制代 谢组学样本溶液； 4)利用UPLC/HRMS平台，采集步骤3)中所述代谢组学样本溶液和步骤2)中所述一 系列浓度梯度的相对定量标准曲线校正溶液的原始质谱数据； 5)基于步骤4)中所述原始质谱数据，获得一级质谱转置数据和二级质谱转置数 据，并基于所述一级质谱转置数据，获得包括多种一级变量信息的解卷积结果； 6)结合步骤5)中所述一级质谱转置数据的解卷积结果与所述二级质谱转置数据， 并参比单个同位素内标的一级变量信息和二级变量信息，鉴定同位素内标，并选择用于线 5 CN 111579665 A 说　明　书 3/12 页 性拟合的最优同位素内标； 7)利用步骤2)中所述一系列浓度梯度的相对定量标准曲线校正溶液的浓度及其 在步骤5)中获得的一级变量信息进行线性拟合，获得线性方程； 8)基于步骤7)中所述线性方程，得到步骤3)中所述代谢组学样本溶液的相对定量 结果，并完成主成分分析和一级变量信息的差异代谢物分析；和 9)结合步骤5)中所述一级质谱转置数据的解卷积结果与所述二级质谱转置数据， 完成代谢物鉴定和差异代谢物鉴定。 优选地，在上述方法中，步骤1)中的同位素内标混合溶液通过下列方法制得：先取 适量的多种同位素内标，分别加入溶剂，配制成一定浓度的单一同位素内标母液，再分别取 适量的各种单一同位素内标母液，混合并加入溶剂，得到同位素内标混合溶液。 优选地，在上述方法中，步骤2)中的代谢组学样本为血清或血浆样本，相对定量校 正样本为NIST血清。 优选地，在上述方法中，步骤2)中的一系列浓度梯度的相对定量标准曲线校正溶 液通过下列方法制得：取一系列体积的相对定量校正样本，分别加入同位素内标和蛋白沉 淀试剂，混合，离心，取上清液，浓缩，向残渣中加入复溶溶剂，混合，取上清液，得到一系列 浓度梯度的相对定量标准曲线校正溶液。 优选地，在上述方法中，步骤3)中的代谢组学样本溶液通过下列方法制得：取代谢 组学样本，分别加入同位素内标和蛋白沉淀试剂，混合，离心，取上清液，浓缩，向残渣中加 入复溶溶剂，混合，取上清液，得到代谢组学样本溶液。 优选地，在上述方法中，步骤5)中的一级质谱转置数据和二级质谱转置数据通过 数据转置的方式获得，该数据转置通过软件或算法平台来完成。 优选地，在上述方法中，步骤5)中的解卷积结果通过解卷积的方式获得，该解卷积 通过软件或算法平台来完成。 优选地，在上述方法中，步骤6)中的同位素内标鉴定通过自研算法来完成。 优选地，在上述方法中，步骤6)中的最优同位素内标通过自研算法来选择。 优选地，在上述方法中，步骤8)中的主成分分析通过自适应换算来完成。 优选地，在上述方法中，步骤8)中的差异代谢物分析通过多元统计分析来完成。 优选地，在上述方法中，步骤9)中的代谢物鉴定和差异代谢物鉴定通过软件或算 法平台来完成。 发明的效果 与现有技术相比，本发明的代谢组学相对定量分析方法具有如下有益效果： 1)本发明的研究思路不同于以往的研究模式，无需先从高分辨质谱数据中提取多 反应监测模式(MRM)离子对，再转移到三重四极杆质谱对这些离子对进行定量扫描，而是直 接从高分辨率质谱数据中先提取质谱一级变量信息，以同位素内标和NIST血清样本同时作 为校正物质来计算代谢组学样本中代谢物的相对浓度值，通过一级分析获得一级变量的差 异代谢物，通过二级分析得到的代谢物全鉴定表格，特别是明确物质成分或结构的差异代 谢物； 2)本发明的分析方法无需同时使用两种质谱平台(四极杆质谱和高分辨质谱)，仅 用一种(高分辨质谱)即可满足定性和定量的双重需求，成本较低，操作简便，适用性广； 6 CN 111579665 A 说　明　书 4/12 页 3)本发明的分析方法同时以多种同位素内标和NIST血清样本作为校正物质，使得 定量结果更为准确，并且使得各个实验室之间的结果具有兼容性(校准物质均为NIST血清 样本)，解决了现有的代谢组学数据存在孤岛效应的问题； 4)代谢组学样本的预处理简单易行，无目标代谢物类型的歧视效应，适合各种类 型代谢物的定性和定量研究； 5)相比于传统代谢组学研究，本发明的分析方法依赖于计算机算法脚本，可以快 速鉴定代谢物结构，准确率较高，避免了人为筛选的主观性。 附图说明 图1示出了基于UPLC/HRMS的代谢组学相对定量分析方法建立流程图。 图2示出了人血清的正离子模式基峰离子流(BPI)色谱图。 图3示出了人血清的负离子模式基峰离子流(BPI)色谱图。 图4示出了人血清样本在正离子模式下的主成分分析(PCA)得分图。 图5示出了人血清样本在负离子模式下的主成分分析(PCA)得分图。 图6示出了采用代谢组学相对定量分析方法和靶向绝对定量分析方法的人血清样 本中胆碱、甜菜碱、左旋肉碱和肌酐酸4种代谢物浓度的相关散点图。