技术摘要：
本发明公开了一种识别人程序性死亡受体1的DNA适配体及方法和应用，属于生化检测领域。利用Cell‑SELEX技术进行适配体的筛选，将构建的pDisplay/PD‑1N表面展示表达质粒转染L02细胞并用G418进行抗性筛选，获得稳定表达PD‑1N的细胞系L02‑PD‑1N。再以L02‑PD‑1N细胞为  全部
背景技术：
程序性死亡受体1也称为PD-1或CD279，是T细胞表面重要的适应性免疫分子。PD-1 是一种具有288个氨基酸的I型跨膜蛋白，由一个免疫球蛋白(Ig)超家族结构域，一个跨膜 结构域和一个细胞内结构域组成，包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)以及基于免 疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)(Keir  et  al.,2008)。 PD-1具有两个配体分子：PD-L1和PD-L2，属于B7家族成员。PD-1作为免疫检查点分 子，可通过两种机制防御自身免疫：促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死 亡)和减少了调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)的凋亡。研究表明，PD-1与其配体分子在细 胞信号转导中发挥负调控作用，抑制免疫细胞的功能，促进免疫逃逸。PD-1抑制剂可阻断 PD-1/PD-L1间的相互作用，增强免疫系统，可用于治疗癌症(Butte  et  al.,2007)。 肿瘤微环境中T细胞表面的PD-1分子表达水平一般较高(Sharpe  and  Pauken , 2018)，且许多肿瘤细胞以及循环肿瘤细胞一般高表达PD-L1分子(Gandini  et  al.,2016； Syn  et  al.,2017)，抑制PD-1/PD-L1间的相互作用可增强T细胞反应并介导临床前抗肿瘤 活性(Baumeister  et  al.,2016)。 指数富集的配体系统进化技术(SELEX)的筛选方法是指从序列数巨大的随机文库 中筛选出功能性的针对特定靶标的核酸适配体(Ellington  and  Szostak,1990)。该技术是 指经由反复多轮结合，分离，和扩增获得所需单链DNA或RNA的逐步筛选过程，并将这种具有 特异性结合能力的寡核苷酸序列命名为“aptamer”，即核酸适配体(Tuerk  and  Gold , 1990)。适配体可通过静电相互作用，范德华力，氢键，疏水作用，Π-Π堆积以及分子形状互 补等形成特定的空间结构，从而与靶标分子发生高亲和性和高特异性的结合，其解离常数 Kd值通常在皮摩尔到纳摩尔范围内(Hermann  and  Patel,2000)。 适配体也被称为“化学抗体”，在功能上被用作拮抗剂，激动剂或靶向配体。，适配 体与抗体相比具有独特的优势：如化学合成的容易性，小尺寸，低分子量和非免疫原性，且 能根据实际需要对其加以修饰(Zhou  and  Rossi,2017)。适配体的这些特性使其在诊断治 疗等生物医学领域具有极大的应用潜能，基于这些优势，适配体的研究项目在日益增多，获 得的适配体可广泛用于生物诊断，生物标志物发现，分子成像，靶向治疗和药物递送等。 2004年，美国食品药品管理局(FDA)批准了第一个适配体药物pegaptanib(商品名Macugen) 用于治疗老年性黄斑变性新型血管形成(AMD)，这标志适配体药物正式进入临床治疗。
技术实现要素：
本发明的目的之一，提供了一种特异性识别人PD-1N的DNA适配体。 本发明的另一目的在于提供产生上述DNA适配体的筛选及鉴定方法。 3 CN 111593053 A 说　明　书 2/5 页 本发明的目的还在于提供上述DNA适配体的应用，上述DNA适配体(核酸适配体)在 临床诊断和治疗方面具有潜在应用前景。以该DNA适配体(核酸适配体)为核心，可利用生物 素/荧光/酶标/化学发光等标记或多价化修饰用于检测细胞或组织中的PD-1分子，具有用 于结核及肿瘤患者诊断和治疗的潜在应用前景。 具体的技术方案如下： 第一方面，本发明提供一种识别人程序性死亡受体1(PD-1)胞外段(PD-1N)的DNA 适配体的筛选方法，其特征在于：即是产生识别人PD-1N的DNA适配体的筛选方法；包含以下 步骤： (1)用pDisplay/PD-1N重组质粒转染L02细胞，用G418筛选获得L02-PD-1N细胞系， 具体为： 用pDisplay/PD-1N重组质粒转染L02细胞，并用G418抗生素进行抗性筛选，随后利 用蛋白免疫印迹、流式细胞术及RT-qPCR技术验证PD-1N蛋白及基因的表达，获得稳定转染 的L02-PD-1N细胞系。 (2)利用DNA寡核苷酸文库与L02-PD-1N细胞系进行反复的孵育-洗脱-扩增，获得 每一轮富集后的亚文库，具体为： 利用合成的寡核苷酸序列文库与L02-PD-1N稳转细胞系进行反复的孵育-洗脱-扩 增，经过十二轮的筛选后，通过鉴定富集的ssDNA亚文库，获得能特异性结合PD-1N蛋白的 ssDNA。 作为优选方案，还包括步骤(3)：得到各轮富集的ssDNA亚文库通过酶联寡核苷酸 吸附试验和流式细胞术测定亲和力最佳的富集分库，随后通过鉴定单个核酸适配体的亲和 力筛选出具有较好特异性和亲和力的几条候选核酸适配体，具体为： 从第三轮开始，利用不表达PD-1N的L02细胞系进行阴性筛选以去除非特异性结合 的ssDNA序列；利用酶联寡核苷酸吸附试验(ELONA)检测每一轮筛选后得到的ssDNA亚文库 与PD-1N的亲和力，获得亲和力最佳的ssDNA亚文库；通过分子克隆技术将最佳亲和力的 ssDNA亚文库构建至TSV-007VST载体，获得单一的ssDNA序列并利用流式细胞术及共聚焦显 微镜技术鉴定其亲和力与特异性，最终鉴定出最佳的核酸适配体。 进一步地，所述步骤(3)中筛选得到的候选DNA适配体的鉴定方法如下： 利用流式细胞术和共聚焦显微镜技术检测核酸适配体的解离常数kd值及特异性 结合情况，鉴定出其中最佳的DNA适配体。由上述过程产生的针对人PD-1N的DNA适配体，命 名为P13。 第二方面，本发明提供一条特异性识别人程序性死亡受体1(PD-1)的DNA适配体， 其特征在于：所述DNA适配体是通过权利要求3所述的方法制备得到；所述DNA适配体的序列 如SEQ  ID  NO.1所示。 第三方面，本发明提供一种如上述的特异性识别人程序性死亡受体1(PD-1)的DNA 适配体的应用，其特征在于：以该DNA适配体为核心，利用生物素/荧光/酶标/化学发光标记 或多价化修饰用于制备检测结核及肿瘤组织中T淋巴细胞表面的PD-1分子的试剂。 上述核酸适配体可通过荧光标记，能够结合结核及肿瘤患者组织中T淋巴细胞表 面的PD-1分子，具有分子诊断或者靶向治疗的应用潜能。 本发明的优点及有益效果如下： 4 CN 111593053 A 说　明　书 3/5 页 (1)本发明提供的核酸适配体P13通过流式细胞术测定其解离常数在纳摩尔水平 (Kd＝89.5±24 .4nM)，具有较强的亲和力；共聚焦试验证明该适配体能与PD-1N特异性结 合。 (2)本发明提供的核酸适配体P13通过荧光标记可以识别结核及肿瘤患者组织中 浸润T淋巴细胞表面的PD-1分子，表明该适配体具有分子诊断或者靶向治疗的应用潜能。 附图说明 图1.蛋白免疫印迹试验检测L02-PD-1N细胞系中PD-1N的表达 图2.RT-qPCR检测L02-PD-1N细胞系PD-1N的mRNA表达水平。 图3.流式细胞术检测L02-PD-1N细胞系表面PD-1N的表达。 图4.ssDNA亚文库亲和力的检测。ELONA检测各ssDNA亚文库的亲和力。 图5.单个核酸适配体亲和力的检测。ELONA检测单个适配体的亲和力。 图6.测定适配体的解离常数Kd值。流式细胞术测定适配体的解离常数。 图7.适配体P8的特异性鉴定。细胞免疫荧光试验鉴定适配体的特异性。 图8.适配体P13的特异性鉴定。细胞免疫荧光试验鉴定适配体的特异性。 图9.适配体二级结构分析。用软件DNAMAN分析亲和力及特异性最佳的适配体P13 的二级结构(注：结构预测中四种脱氧核苷酸显示为A、G、C、T)。 图10.适配体P13结合结核患者组织中T淋巴细胞表面的PD-1分子。 图11.适配体P13结合肿瘤患者组织中T淋巴细胞表面的PD-1分子。 图12.适配体P13不结合炎性肉芽肿组织中T淋巴细胞。 图13.炎性肉芽肿组织中T淋巴细胞表面PD-1的表达分析。 (其中：图10-13中FITC的绿色荧光调变为白色)