技术摘要：
本发明实施例公开了一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系及其构建方法与应用，属于生物技术领域。所述橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明操作简单，建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系，有效避免了传统  全部
背景技术：
巴西橡胶树为大戟科科橡胶树属植物，原产于亚马逊森林。中国植胶区主要分布 于海南、广东、广西、云南等地区，其中海南为主要植胶区。橡胶树为落叶乔木，树皮中的乳 管生产乳状汁液的胶乳，胶乳是巴西橡胶树的主要次生代谢物质，也是天然橡胶的主要来 源。橡胶树的经济寿命约30年，生长寿命约60年。通过常规杂交育种手段，培育一个橡胶树 新品种需要20～30年。遗传转化体系的建立是有效验证橡胶树基因功能、缩短橡胶树育种 周期、加快新品种培育的必经途径。 目前对橡胶树的相关基因的研究才开始起步，经过基因组测序后，科研工作者获 得了很多基因序列，并克隆了很多基因，却无法进一步深入研究，其中主要的原因是其遗传 转化体系不成熟，遗传转化的检测手段也比较少。目前用于橡胶树农杆菌遗传转化的受体 主要是胚性愈伤组织，利用其它材料作为受体还没有报道。胚性愈伤组织作为转化受体存 在如下缺陷：1.取材受季节限制，剥离雄蕊费工费时，花药再生能力差，很难获得胚性愈伤 组织，因此无法满足一年四季的转化要求；2.组织再生能力差，很难获得转基因植株，难以 满足日益增长的科研和生产需求；3 .愈伤组织作为转化受体，遗传转化效率低。VIGS (virus-induced  gene  silencing)技术是一种高效的遗传转化体系，已应用于多种植物进 行基因功能验证，但该体系目前在橡胶树上尚无应用。
技术实现要素：
为此，本发明实施例提供一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系及其 构建方法与应用。 本发明利用VIGS系统在植物体内可移动的特点，以橡胶树幼苗的根、茎和叶为受 体，通过侵染受体植株部位的不同条件进行的病毒诱导基因沉默体系，系统建立一种高效 的不同于已报道的橡胶树遗传转化方法。本发明操作简单、快速、有效，避免传统遗传转化 需要繁重的劳动和效率低下的缺点。该体系可有效降低橡胶树中HbPDS基因的表达水平，可 以获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证橡胶树基因功能的问题，为挖掘具有 重要农艺性状的橡胶树基因，为培育优良的橡胶树品种奠定基础。 为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案： 根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供了一种橡胶树八氢番茄红素脱 氢酶基因VIGS沉默体系，具有如SEQ  ID  NO:1所示的核苷酸序列。 根据本发明实施例的第二方面，本发明实施例提供了上述橡胶树八氢番茄红素脱 氢酶基因VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤： 3 CN 111593065 A 说　明　书 2/6 页 S1、根据橡胶树八氢番茄红素脱氢酶HbPDS基因序列信息并结合pTRV2载体的序列 信息设计特异引物： HbPDS1F：GAATTCGGCGCTTAACTTTATTAACCCTG， HbPDS1R：CTCGAGCTTTAGTTTCCTGTCGAACCATATG； S2、特异引物以橡胶树cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得大小为409bp的HbPDS目 的基因片段； S3、将步骤S2得到的HbPDS目的基因片段连接到PMD-18T载体上； S3、将连接到PMD-18T载体上的HbPDS目的基因片段用酶切后连接到采用同样酶切 后的pTRV2载体上，得到pTRV2-HbPDS重组质粒； S4、将pTRV2-HbPDS重组质粒转化到农杆菌中，即得到VIGS沉默体系。 根据本发明实施例的第三方面，本发明实施例提供了上述橡胶树八氢番茄红素脱 氢酶基因VIGS沉默体系的应用，对两蓬叶期的橡胶树幼苗的根、茎和叶在室温下进行侵染， 或者抽真空进行侵染；将侵染后的橡胶树幼苗先放在28℃下暗培养12h，然后将橡胶树幼苗 放在温室苗圃中培养。 进一步地，侵染使用10mM  MgCl2 10mM  MES 150μMAS的混合溶液。 进一步地，抽真空进行侵染时，真空度为0.08MPa，侵染时间为1小时。在此条件下， 可增加侵染效率。 本发明实施例具有如下优点： 本发明的转化受体与以往报道均不同，橡胶树幼苗作为转化受体具有明显优势： 既可以用种子苗也可以用组培苗，一年四季均有材料，可满足随时转化需要。根据橡胶树八 氢番茄红素脱氢酶(HbPDS)的编码基因序列设计特异引物，通过PCR扩增在橡胶树中获得 409bp的cDNA片段。将获得的HbPDS  cDNA片段构建到pTRV2载体上，获得pTRV2-HbPDS重组质 粒，通过农杆菌介导的侵染受体植株根、茎和叶部位的病毒诱导基因沉默体系。本发明操作 简单，建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系，有效避免了传统遗传转化需要繁重的劳 动和效率低下的缺点。该体系能够有效降低橡胶树中HbPDS基因的表达水平，获得病毒诱导 的基因沉默性状，进而解决有效验证橡胶树基因功能的问题，为挖掘具有重要农艺性状的 橡胶树基因，为培育优良的橡胶树品种奠定基础。 附图说明 为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方 式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅 仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 提供的附图引伸获得其它的实施附图。 图1为病毒诱导的橡胶树八氢番茄红素脱氢酶(HbPDS)基因高效沉默体系的流程 图。 图2为HbPDS  cDNA片段扩增电泳图和pTRV2-HbPDS重组质粒鉴定；其中：1：DNA  Marker；2：pTRV2-HbPDS重组质粒；3：pTRV2-HbPDS重组质粒双酶切；4：pTRV2-HbPDS重组质 粒PCR产物；5：DNA  Marker。 图3为对照处理和转橡胶树八氢番茄红素脱氢酶(HbPDS)基因处理橡胶树后出现 4 CN 111593065 A 说　明　书 3/6 页 的叶片白化的表型。 图4为qRT-PCR检测对照植株叶片和转基因植株叶片的HbPDS基因相对表达量。