技术摘要：
本发明提供一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记。其主要特征是，提取东北林蛙脚趾组织的基因组，以提取的基因组DNA为模板，以含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对进行PCR扩增反应。通过14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO:3所示 全部
背景技术：
东北林蛙（Rana Dybowskii）隶属于两栖纲（Amphibian）无尾目（Anura）蛙科 （Ranidae）蛙属（Rana）。雌性东北林蛙，即《中药大辞典》中所述的中国林蛙，干燥后的输卵 管被称为哈蟆油或林蛙油，是一种久负盛名的滋补中药。研究表明，经常服用林蛙油，可补 充人体所需的18种必需氨基酸，增强体力和记忆力，增强对各种疾病的免疫功能。 因为巨大的经济利益的驱使，人们长期以来对野生东北林蛙进行“灭绝式”抓捕。 随着林蛙的野生资源越捕越少，个体越捕越小，而市场需求越来越大，市场价格逐年上涨， 供需矛盾日益加剧，人们不得不寻求人工养殖林蛙之路。2010年，吉林省林蛙养殖产值达到 15亿元。 在东北林蛙养殖过程中，养殖群体雄性比例过高这一问题严重影响了东北林蛙养 殖的经济效益。东北林蛙性别分化由遗传因素决定，同时受环境因素修饰，并在变态结束前 完成，此后个体生理性别不再改变。由于环境因素对东北林蛙性别分化具有修饰作用，因此 东北林蛙会出现遗传性别与生理性别不一致的个体，即性逆转个体。动物的性逆转个体在 单性育种中具有非常重要的作用，已经成功运用于全雄罗非鱼和高雌半滑舌鳎等鱼类的单 性生产中。东北林蛙的生理性别可以通过外部形态观察得以鉴定，但由于东北林蛙核型分 析中未能观察到异型性染色体，所以无法对东北林蛙遗传性别进行鉴定，从而无法成功获 得性逆转个体。 性别特异性DNA分子标记是物种遗传性别鉴定有效载体。因此，获取一种能够鉴定 东北林蛙遗传性别的DNA分子标记是构建全雌或高雌养殖群体的关键技术之一。然而，目前 尚未见东北林蛙性别特异性DNA分子标记的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述技术中存在的问题，提供了一种鉴定东北林蛙遗传性别 的DNA分子标记及鉴定方法。利用本发明的技术方案，可以确定东北林蛙的遗传性别。 本发明的目的是这样实现的，其特征是，按以下步骤操作： （1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA， （2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQ ID NO :1所示序列，即5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’，下游引物为SEQ ID NO :2所示序列， 即5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’。 （3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO : 4 CN 111593128 A 说 明 书 2/6 页 3所示核苷酸序列对应条带，即图2所示的方框内条带，的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失 SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。 （4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分 子标记，即SEQ ID NO :3。所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列， GGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGAC CGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGT TTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC 本发明的有益效果 在缺少全基因组数据作为参考，且无异型性染色体的情况下，需要鉴定东北林蛙遗传 性别是非常困难的。利用性别特异性DNA分子标记是一种鉴定物种遗传性别的有效途径。本 发明获得了一个东北林蛙遗传雄性特异性DNA分子标记，成功地鉴定出东北林蛙的遗传性 别，并确定东北林蛙的性别决定类型为XY型。在生理雄性个体中，通过本发明鉴定，我们获 得了缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带性逆转的伪雄个体，即生理为雄性，但遗 传为雌性的个体。 2019年春季，我们以伪雄个体为父本，以正常雌性为母本进行抱对，获得了2个受 精卵团。从每个卵团取240个受精卵，在20℃件下孵化，并饲养至变态结束。通过解剖观察， 鉴定变态幼蛙的生理性别。变态幼蛙生理性别雌雄比分别为：164/17和152/14，生理雌性所 占比例分别为90.61%和91.57%。 此验证性试验说明，东北林蛙性逆转为伪雄的个体，其子代在20℃温度条件下均 能大多数发育为生理雌性。本发明能实现对东北林蛙养殖群体性别控制，从而提高东北林 蛙养殖的经济效益。 图1是本发明东北林蛙脚趾DNA的 1.2%琼脂糖凝胶电泳图 图2是本发明PCR扩增产物14%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图
本发明提供一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记。其主要特征是，提取东北林蛙脚趾组织的基因组，以提取的基因组DNA为模板，以含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对进行PCR扩增反应。通过14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO:3所示 全部
背景技术：
东北林蛙（Rana Dybowskii）隶属于两栖纲（Amphibian）无尾目（Anura）蛙科 （Ranidae）蛙属（Rana）。雌性东北林蛙，即《中药大辞典》中所述的中国林蛙，干燥后的输卵 管被称为哈蟆油或林蛙油，是一种久负盛名的滋补中药。研究表明，经常服用林蛙油，可补 充人体所需的18种必需氨基酸，增强体力和记忆力，增强对各种疾病的免疫功能。 因为巨大的经济利益的驱使，人们长期以来对野生东北林蛙进行“灭绝式”抓捕。 随着林蛙的野生资源越捕越少，个体越捕越小，而市场需求越来越大，市场价格逐年上涨， 供需矛盾日益加剧，人们不得不寻求人工养殖林蛙之路。2010年，吉林省林蛙养殖产值达到 15亿元。 在东北林蛙养殖过程中，养殖群体雄性比例过高这一问题严重影响了东北林蛙养 殖的经济效益。东北林蛙性别分化由遗传因素决定，同时受环境因素修饰，并在变态结束前 完成，此后个体生理性别不再改变。由于环境因素对东北林蛙性别分化具有修饰作用，因此 东北林蛙会出现遗传性别与生理性别不一致的个体，即性逆转个体。动物的性逆转个体在 单性育种中具有非常重要的作用，已经成功运用于全雄罗非鱼和高雌半滑舌鳎等鱼类的单 性生产中。东北林蛙的生理性别可以通过外部形态观察得以鉴定，但由于东北林蛙核型分 析中未能观察到异型性染色体，所以无法对东北林蛙遗传性别进行鉴定，从而无法成功获 得性逆转个体。 性别特异性DNA分子标记是物种遗传性别鉴定有效载体。因此，获取一种能够鉴定 东北林蛙遗传性别的DNA分子标记是构建全雌或高雌养殖群体的关键技术之一。然而，目前 尚未见东北林蛙性别特异性DNA分子标记的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述技术中存在的问题，提供了一种鉴定东北林蛙遗传性别 的DNA分子标记及鉴定方法。利用本发明的技术方案，可以确定东北林蛙的遗传性别。 本发明的目的是这样实现的，其特征是，按以下步骤操作： （1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA， （2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQ ID NO :1所示序列，即5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’，下游引物为SEQ ID NO :2所示序列， 即5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’。 （3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO : 4 CN 111593128 A 说 明 书 2/6 页 3所示核苷酸序列对应条带，即图2所示的方框内条带，的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失 SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。 （4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分 子标记，即SEQ ID NO :3。所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列， GGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGAC CGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGT TTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC 本发明的有益效果 在缺少全基因组数据作为参考，且无异型性染色体的情况下，需要鉴定东北林蛙遗传 性别是非常困难的。利用性别特异性DNA分子标记是一种鉴定物种遗传性别的有效途径。本 发明获得了一个东北林蛙遗传雄性特异性DNA分子标记，成功地鉴定出东北林蛙的遗传性 别，并确定东北林蛙的性别决定类型为XY型。在生理雄性个体中，通过本发明鉴定，我们获 得了缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带性逆转的伪雄个体，即生理为雄性，但遗 传为雌性的个体。 2019年春季，我们以伪雄个体为父本，以正常雌性为母本进行抱对，获得了2个受 精卵团。从每个卵团取240个受精卵，在20℃件下孵化，并饲养至变态结束。通过解剖观察， 鉴定变态幼蛙的生理性别。变态幼蛙生理性别雌雄比分别为：164/17和152/14，生理雌性所 占比例分别为90.61%和91.57%。 此验证性试验说明，东北林蛙性逆转为伪雄的个体，其子代在20℃温度条件下均 能大多数发育为生理雌性。本发明能实现对东北林蛙养殖群体性别控制，从而提高东北林 蛙养殖的经济效益。 图1是本发明东北林蛙脚趾DNA的 1.2%琼脂糖凝胶电泳图 图2是本发明PCR扩增产物14%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图
