技术摘要：
本发明公开了一种蛋白修饰的PLGA微球及以此构建的组织工程化神经。本发明将微球负载治疗周围神经损伤的活性物质并与组织工程化神经结合，研究显示，所制得的组织工程化神经能有效促进周围神经损伤后的神经再生。
背景技术：
： 周围神经损伤是临床常见病，通常导致麻痹、瘫痪乃至丧失对相应身体部位的自 主控制，严重影响了患者的生活质量。目前通过单纯缝合断端神经的外科手术修复效果并 不令人满意，并且作为修复周围神经缺损金标准的自体神经移植，由于自体神经供体来源 困难，移植造成二次损伤等诸多因素，临床应用受到限制。因此，构建合适的组织工程化神 经以替代自体神经修复周围神经缺损，具有广阔的应用前景。 组织工程化神经一般由神经导管支架，结合应用多种生长因子或种子细胞等因素 构成。而种子细胞常有来源困难，或者同种异体产生免疫原性等诸多问题，临床应用受到限 制；将生长因子添加到支架材料中，需考虑根据各自理化特性维持稳定性和效率等问题。 因此开发新的具有修复神经损伤的生物活性物质，并将其与组织工程化神经结 合，具有更广泛的临床应用价值。
技术实现要素：
本发明前期研究(申请号为2020103158417的中国专利申请)公开了一种鸦胆子脂 溶性提取物，研究显示鸦胆子脂溶性提取物能促进周围DRG神经元神经突起生长，以及促进 周围神经系统胶质细胞施万细胞的分裂增殖，具有促进周围神经再生的作用。本发明在此 基础上设计了一种蛋白修饰的PLGA微球，以鸦胆子脂溶性提取物作为活性物质，应用于组 织工程化神经的构建。本发明将鸦胆子脂溶性提取物与层粘连蛋白修饰PLGA微球结合，制 备具有缓释效果的层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物微球，该微球能显著促进体外周 围DRG神经元突起生长。进一步地将含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球结合到丝素蛋白神经 导管内的丝素蛋白纤维上，构建含层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物微球的组织工程 化神经，体内实验证明该组织工程化神经能有效促进周围神经损伤后再生神经的髓鞘形 成，为临床治疗周围神经损伤提供新的选择。 本发明具体技术方案如下： 一种蛋白修饰的PLGA微球，将PLGA与胶原蛋白、纤维连接蛋白、丝素蛋白、层粘连 蛋白中的一种或几种通过交联剂交联。所述交联剂为化学交联剂或生物交联剂，优选生物 交联剂，如京尼平、EDC/NHS碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、海藻酸钠等，优选京尼平。 优选的，所述蛋白与PLGA的质量比为1:1-10。更优选为1:3。 优选的，所述鸦胆子脂溶性提取物与PLGA的质量比为1-10:1。更优选为3-5:1。 本发明一个优选的方案为层粘连蛋白修饰的PLGA缓释微球。 本发明所述微球可负载治疗周围神经损伤的活性物质。所述活性物质选自细胞、 多糖、多肽、蛋白、核酸、化合物或者天然提取物中的一种或几种。如神经营养因子类物质、 3 CN 111544648 A 说 明 书 2/10 页 细胞生长因子类物质、细胞外基质类物质、银杏提取物、天麻提取物、鸦胆子脂溶性提取物 中的一种或几种。 本发明一个具体的示例，选择鸦胆子脂溶性提取物作为活性物质。优选采用鸦胆 子脂溶性提取物为采用无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液提取得到，无水乙醇的体积百分为 45％～85％。更优选混合溶液中无水乙醇的体积百分为75％。进一步的，可采用超声波提 取。优选超声波频率20kHz，功率为750W，时间为60min，料液比为1∶5g/mL。 本发明所述微球表面光滑、粒径均一(bar＝5μm)；微球直径多集中在2.5μm。 本发明另一目的在于提供所述的蛋白修饰的PLGA微球在制备治疗周围神经缺损 药物或者组织工程化神经中的应用。本发明将通过使用活性蛋白修饰PLGA，不仅能够提高 PLGA缓释微球生物相容性和材料生物活性，所制得的微球具有很好的缓释能力，还能够促 进神经细胞粘附生长。 本发明考察了使用不同浓度层粘连蛋白制备的层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶 性提取物缓释微球对体外培养DRG神经元突起生长的影响。结果显示使用1～3mg/ml层粘连 蛋白制得的缓释微球能够促进DRG神经元突起生长，且使用1mg/ml层粘连蛋白制得的缓释 微球促进DRG神经元突起生长的效果最好，显著优于较高浓度的9mg/ml，以及较低浓度的 0.33mg/ml和0.11mg/ml的层粘连蛋白。 本发明另一目的在于提供一种负载蛋白修饰的PLGA微球的组织工程化神经，将负 载治疗周围神经损伤的活性物质的蛋白修饰的PLGA微球采用吸附、涂覆、混合、包埋、交联 剂交联、三维打印、静电纺丝中的一种或几种方式将负载于组织工化程神经内/外表面或内 部。 所述组织工程化神经可采用现有技术下常规使用的材料，如丝素蛋白、壳聚糖、聚 乙醇酸、聚己内酯、胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种，可采用现有技术下常规使用的形 状，如导管，支架、手术缝线等，进一步的，组织工程化神经具有一定孔隙或内部具有模拟神 经纤维。 优选的，本发明所述组织工程化神经为丝素蛋白神经导管，更进一步的，导管内还 具有纤维。 本发明一个优选的方案：将层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球， 通过生物交联剂京尼平固定到丝素蛋白纤维上，得到层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性 提取物缓释微球的丝素蛋白纤维。将含层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球的丝素纤维装配进入 丝素蛋白神经导管中，丝素蛋白神经导管长度10mm，外径约为2.2mm，内径约为1.5mm。通常 每根丝素蛋白神经导管中平行装入10根含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的丝素纤维，构建 得到含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经。 本发明将构建的含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经，应用于修复 大鼠坐骨神经缺损模型，术后12周观察再生神经髓鞘形成。结果显示将10mL浓度为10mg/mL 鸦胆子脂溶性提取物负载于微球制得的微球实验组，髓鞘厚度优于阴性对照组；将10mL浓 度为50mg/mL鸦胆子脂溶性负载于微球制得的微球实验组，轴突直径和髓鞘厚度与阴性对 照未负载鸦胆子脂溶性提取物的层粘连蛋白PLGA缓释微球组相比，均有显著性差异。 本发明优点： 1 .本发明使用分子量较大的50-75kDa PLGA制作微球，较大分子量能获得较长释 4 CN 111544648 A 说 明 书 3/10 页 放周期，适合周围神经再生初始关键阶段的需要，并且通过应用天然高分子蛋白或细胞外 基质类蛋白修饰PLGA，利用这些蛋白自身的性质，促进神经损伤修复，制得的微球还具有缓 释的效果，特别是层粘连蛋白修饰的PLGA微球缓释周期长，缓释效果最好。 2.本发明前期研究发现，通过特定比例无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液结合超声波 的方法，提取制备的鸦胆子脂溶性提取物，能显著促进周围DRG神经元突起生长，以及促进 周围胶质施万细胞分裂增殖，提示鸦胆子脂溶性提取物具有促进周围神经再生的作用。本 发明将鸦胆子脂溶性提取物与层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球相结合，制备得到层粘连蛋 白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球，该微球具有生物相容性好，易修饰改性等优点，并 且粒径均一，形态规则，能达到有效的缓释效果，释放周期较长。进一步将层粘连蛋白- PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球结合到丝素蛋白神经导管内的丝素蛋白纤维上，成功 构建含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经，体内实验发现该组织工程化神经 能有效促进周围神经损伤后再生神经的髓鞘形成。 附图说明 图1为CCK8检测鸦胆子脂溶性提取物的细胞毒性。 图2免疫组化检测鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的作用。(图2A不同 剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的免疫组化染色形态图；图2B不同剂量 的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长长度的柱形统计结果图)。 图3EdU染色检测鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用。(图3A不同剂量的 鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用的EdU染色形态图；图3B不同剂量的鸦胆子脂 溶性提取物对施万细胞增殖作用的柱形统计结果图)。 图4大鼠坐骨神经缺损模型应用鸦胆子脂溶性提取物后的坐骨神经功能指数。 图5HPLC检测不同蛋白修饰PLGA缓释微球鸦胆子脂溶性提取物的释放效应。 图6电镜观察微球与不同浓度层粘连蛋白修饰缓释微球对DRG神经突起生长的影 响(图6A层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的透射电镜代表图；图6B层粘连 蛋白- PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球直径的柱形统计图；图6C为免疫荧光细胞化 学染色柱形统计图)。 图7神经三色染色观察组织工程化神经修复后的再生神经髓鞘形成情况。(图7A神 经三色染色的代表图；图7B神经三色染色统计结果)。
本发明公开了一种蛋白修饰的PLGA微球及以此构建的组织工程化神经。本发明将微球负载治疗周围神经损伤的活性物质并与组织工程化神经结合，研究显示，所制得的组织工程化神经能有效促进周围神经损伤后的神经再生。
背景技术：
： 周围神经损伤是临床常见病，通常导致麻痹、瘫痪乃至丧失对相应身体部位的自 主控制，严重影响了患者的生活质量。目前通过单纯缝合断端神经的外科手术修复效果并 不令人满意，并且作为修复周围神经缺损金标准的自体神经移植，由于自体神经供体来源 困难，移植造成二次损伤等诸多因素，临床应用受到限制。因此，构建合适的组织工程化神 经以替代自体神经修复周围神经缺损，具有广阔的应用前景。 组织工程化神经一般由神经导管支架，结合应用多种生长因子或种子细胞等因素 构成。而种子细胞常有来源困难，或者同种异体产生免疫原性等诸多问题，临床应用受到限 制；将生长因子添加到支架材料中，需考虑根据各自理化特性维持稳定性和效率等问题。 因此开发新的具有修复神经损伤的生物活性物质，并将其与组织工程化神经结 合，具有更广泛的临床应用价值。
技术实现要素：
本发明前期研究(申请号为2020103158417的中国专利申请)公开了一种鸦胆子脂 溶性提取物，研究显示鸦胆子脂溶性提取物能促进周围DRG神经元神经突起生长，以及促进 周围神经系统胶质细胞施万细胞的分裂增殖，具有促进周围神经再生的作用。本发明在此 基础上设计了一种蛋白修饰的PLGA微球，以鸦胆子脂溶性提取物作为活性物质，应用于组 织工程化神经的构建。本发明将鸦胆子脂溶性提取物与层粘连蛋白修饰PLGA微球结合，制 备具有缓释效果的层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物微球，该微球能显著促进体外周 围DRG神经元突起生长。进一步地将含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球结合到丝素蛋白神经 导管内的丝素蛋白纤维上，构建含层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物微球的组织工程 化神经，体内实验证明该组织工程化神经能有效促进周围神经损伤后再生神经的髓鞘形 成，为临床治疗周围神经损伤提供新的选择。 本发明具体技术方案如下： 一种蛋白修饰的PLGA微球，将PLGA与胶原蛋白、纤维连接蛋白、丝素蛋白、层粘连 蛋白中的一种或几种通过交联剂交联。所述交联剂为化学交联剂或生物交联剂，优选生物 交联剂，如京尼平、EDC/NHS碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、海藻酸钠等，优选京尼平。 优选的，所述蛋白与PLGA的质量比为1:1-10。更优选为1:3。 优选的，所述鸦胆子脂溶性提取物与PLGA的质量比为1-10:1。更优选为3-5:1。 本发明一个优选的方案为层粘连蛋白修饰的PLGA缓释微球。 本发明所述微球可负载治疗周围神经损伤的活性物质。所述活性物质选自细胞、 多糖、多肽、蛋白、核酸、化合物或者天然提取物中的一种或几种。如神经营养因子类物质、 3 CN 111544648 A 说 明 书 2/10 页 细胞生长因子类物质、细胞外基质类物质、银杏提取物、天麻提取物、鸦胆子脂溶性提取物 中的一种或几种。 本发明一个具体的示例，选择鸦胆子脂溶性提取物作为活性物质。优选采用鸦胆 子脂溶性提取物为采用无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液提取得到，无水乙醇的体积百分为 45％～85％。更优选混合溶液中无水乙醇的体积百分为75％。进一步的，可采用超声波提 取。优选超声波频率20kHz，功率为750W，时间为60min，料液比为1∶5g/mL。 本发明所述微球表面光滑、粒径均一(bar＝5μm)；微球直径多集中在2.5μm。 本发明另一目的在于提供所述的蛋白修饰的PLGA微球在制备治疗周围神经缺损 药物或者组织工程化神经中的应用。本发明将通过使用活性蛋白修饰PLGA，不仅能够提高 PLGA缓释微球生物相容性和材料生物活性，所制得的微球具有很好的缓释能力，还能够促 进神经细胞粘附生长。 本发明考察了使用不同浓度层粘连蛋白制备的层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶 性提取物缓释微球对体外培养DRG神经元突起生长的影响。结果显示使用1～3mg/ml层粘连 蛋白制得的缓释微球能够促进DRG神经元突起生长，且使用1mg/ml层粘连蛋白制得的缓释 微球促进DRG神经元突起生长的效果最好，显著优于较高浓度的9mg/ml，以及较低浓度的 0.33mg/ml和0.11mg/ml的层粘连蛋白。 本发明另一目的在于提供一种负载蛋白修饰的PLGA微球的组织工程化神经，将负 载治疗周围神经损伤的活性物质的蛋白修饰的PLGA微球采用吸附、涂覆、混合、包埋、交联 剂交联、三维打印、静电纺丝中的一种或几种方式将负载于组织工化程神经内/外表面或内 部。 所述组织工程化神经可采用现有技术下常规使用的材料，如丝素蛋白、壳聚糖、聚 乙醇酸、聚己内酯、胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种，可采用现有技术下常规使用的形 状，如导管，支架、手术缝线等，进一步的，组织工程化神经具有一定孔隙或内部具有模拟神 经纤维。 优选的，本发明所述组织工程化神经为丝素蛋白神经导管，更进一步的，导管内还 具有纤维。 本发明一个优选的方案：将层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球， 通过生物交联剂京尼平固定到丝素蛋白纤维上，得到层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性 提取物缓释微球的丝素蛋白纤维。将含层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球的丝素纤维装配进入 丝素蛋白神经导管中，丝素蛋白神经导管长度10mm，外径约为2.2mm，内径约为1.5mm。通常 每根丝素蛋白神经导管中平行装入10根含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的丝素纤维，构建 得到含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经。 本发明将构建的含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经，应用于修复 大鼠坐骨神经缺损模型，术后12周观察再生神经髓鞘形成。结果显示将10mL浓度为10mg/mL 鸦胆子脂溶性提取物负载于微球制得的微球实验组，髓鞘厚度优于阴性对照组；将10mL浓 度为50mg/mL鸦胆子脂溶性负载于微球制得的微球实验组，轴突直径和髓鞘厚度与阴性对 照未负载鸦胆子脂溶性提取物的层粘连蛋白PLGA缓释微球组相比，均有显著性差异。 本发明优点： 1 .本发明使用分子量较大的50-75kDa PLGA制作微球，较大分子量能获得较长释 4 CN 111544648 A 说 明 书 3/10 页 放周期，适合周围神经再生初始关键阶段的需要，并且通过应用天然高分子蛋白或细胞外 基质类蛋白修饰PLGA，利用这些蛋白自身的性质，促进神经损伤修复，制得的微球还具有缓 释的效果，特别是层粘连蛋白修饰的PLGA微球缓释周期长，缓释效果最好。 2.本发明前期研究发现，通过特定比例无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液结合超声波 的方法，提取制备的鸦胆子脂溶性提取物，能显著促进周围DRG神经元突起生长，以及促进 周围胶质施万细胞分裂增殖，提示鸦胆子脂溶性提取物具有促进周围神经再生的作用。本 发明将鸦胆子脂溶性提取物与层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球相结合，制备得到层粘连蛋 白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球，该微球具有生物相容性好，易修饰改性等优点，并 且粒径均一，形态规则，能达到有效的缓释效果，释放周期较长。进一步将层粘连蛋白- PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球结合到丝素蛋白神经导管内的丝素蛋白纤维上，成功 构建含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经，体内实验发现该组织工程化神经 能有效促进周围神经损伤后再生神经的髓鞘形成。 附图说明 图1为CCK8检测鸦胆子脂溶性提取物的细胞毒性。 图2免疫组化检测鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的作用。(图2A不同 剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的免疫组化染色形态图；图2B不同剂量 的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长长度的柱形统计结果图)。 图3EdU染色检测鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用。(图3A不同剂量的 鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用的EdU染色形态图；图3B不同剂量的鸦胆子脂 溶性提取物对施万细胞增殖作用的柱形统计结果图)。 图4大鼠坐骨神经缺损模型应用鸦胆子脂溶性提取物后的坐骨神经功能指数。 图5HPLC检测不同蛋白修饰PLGA缓释微球鸦胆子脂溶性提取物的释放效应。 图6电镜观察微球与不同浓度层粘连蛋白修饰缓释微球对DRG神经突起生长的影 响(图6A层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的透射电镜代表图；图6B层粘连 蛋白- PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球直径的柱形统计图；图6C为免疫荧光细胞化 学染色柱形统计图)。 图7神经三色染色观察组织工程化神经修复后的再生神经髓鞘形成情况。(图7A神 经三色染色的代表图；图7B神经三色染色统计结果)。
