技术摘要：
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法，所述的植物乳杆菌，菌株代码为YJY19‑08，保藏号为CGMCC No.18401；该菌株具有较强的生长能力和产酸能力，其发酵饲料产品保存时间长、植物乳杆菌存活率高，能够明显提高畜禽采食量、 全部
背景技术：
在饲料中添加抗生素可以提高仔猪生长性能及降低腹泻率和死亡率。目前中国的 养殖场中都普遍使用含有抗生素的饲料添加剂，以达到预防疾病和促进生长的目的。这将 增加动物体内致病性细菌产生耐药性的风险，并使这些耐药细菌和基因传递给人类。2006 年1月1日，欧盟已全面禁止抗生素类添加剂在动物饲料中的应用，其他国家也加大了对抗 生素的使用限制。寻找安全、高效、对环境无污染的替代品是当前急待解决的问题。 发酵饲料可以看作为活菌制剂和发酵底物的复合物，是以植物性农副产品为主要 原料(底物)，通过微生物的代谢作用，降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质，生成有 机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料或饲料 原料。 植物乳酸杆菌属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，利用乳酸菌来发酵饲料，通过饲喂 畜禽发酵饲料，可以维持畜禽肠道内微生态平衡而发挥作用，可以降低养殖室内的氨气、硫 化氢等有害气体的浓度，并且具有防治疾病、增强机体免疫力、提高生长性能、无毒副作用、 无耐药性、无残留、促进生长、增加体重等优点。乳酸菌是我国农业部公布的可直接饲喂动 物且允许使用的饲料级益生菌菌种之一，以其发酵饲料饲喂畜禽具有良好的抗菌性能、稳 定性及对动物和人具有很好的益生作用而被用于畜禽养殖具有广阔的前景。 因此，从自然界筛选出更好的具有降解有机胺类物质功能的菌株成为研究人员的 重要任务之一。
技术实现要素：
本发明针对上述技术存在的不足，提供一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲 料的方法，所述的植物乳杆菌，菌株代码为YJY19-08，保藏号为CGMCC No.18401；该菌株具 有较强的生长能力和产酸能力，其发酵饲料产品保存时间长、植物乳杆菌存活率高，能够明 显提高畜禽采食量、促进营养消化吸收、降低料肉比，具有较高的利用价值。 本发明提供的具体技术方案是： 本发明获得了一株新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其生物保藏编 号为CGMCC No.18401，命名为YJY19-08，其具体获得方法如下： 该菌株是发明人从山东某养猪场厂新鲜粪便中取样，经初筛和复筛得到的一株高 效植物乳杆菌菌株，其筛选过程如下：无菌操作取新鲜猪粪样1g，用无菌生理盐水稀释成 100倍、1000倍的均匀稀释液，取0.1mL稀释液涂布于含有碳酸钙的固体MRS培养基中，35℃ 恒温培养48h，挑选能够产生透明圈的单菌落划线培养，挑选单菌落于甘油培养基中低温保 藏， 3 CN 111593010 A 说 明 书 2/6 页 将低温保藏的菌株接种到200mL液体MRS培养基中，32℃培养48h，检测发酵液中活 菌含量、pH和产酸量；将活力最高、产酸能力最强的乳酸菌菌种送至中国科学院微生物研究 所进行鉴定，根据测序结果，鉴定为植物乳杆菌，该菌株的形态学特征：菌株在固体MRS培养 基呈圆形，菌落较小，边缘整齐，菌体外表面呈乳白色，凸起明亮，培养基内菌落圆扁形。在 显微镜下观察，为杆状，将该菌株送至中国科学院微生物研究所进行16S rDNA测序，该序列 如Seq ID No:1所示，根据测序结果鉴定其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)； 发明人进一步对其进行了生物保藏，生物保藏编号为CGMCC No.18401； 发明人将该菌株进行了相关产酸实验，结果发现该植物乳杆菌生长速度较快、产 酸量高，32℃条件下发酵24h菌量可达到2.8*109CFU/mL，产酸量可达到12.3g/L。 由此，发明人将其应用于生产发酵饲料，分别为制备植物乳杆菌发酵液和制备植 物乳杆菌固体发酵产品： 其中制备植物乳杆菌发酵液的具体步骤如下： (1)菌种活化：取10-30μL冻存的植物乳杆菌接种于含有200mL MRS液体无菌培养 基中，置于28-38℃，160-180rpm振荡培养至对数期； (2)液体种子制备：将活化的菌种200mL转接到含有1000mL MRS液体无菌培养基 中，于28-38℃，160-180rpm振荡培养24h得到液体种子； (3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为 70％的20L种子罐中扩大培养，具体的培养条件为：保持罐温25-28℃，罐压30-40kpa ,搅拌 速率100-120r/min，通气量1：0.2-0.4，pH 3.4-3.6，发酵76-96小时；种子罐中的培养基是 MRS液体无菌培养基； (4)生产罐发酵：将种子液按2-10％v/v的接种量接入装液量为70％的生产罐的培 养基中培养，发酵结束后菌体数量达到5.0*109/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得植 物乳杆菌发酵液； 上述步骤(4)生产罐中的培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸 二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。 上述获得的发酵液可以作为饲料添加剂直接使用，饲喂前将上述发酵液与常规普 通固体饲料按1：9-1：19的重量比例混合后直接饲喂即可； 除此之外，还可以以上述发酵液为起始进行固体发酵获得相应的固体发酵产品， 具体步骤如下： (5)接种与发酵：将获得的植物乳杆菌发酵液按每克0.01-0.1毫升接种到固体培 养基中，混合均匀，25-32℃条件下密封发酵72h，得到固体发酵产品； 上述固体培养基组成按重量百分比为：次粉15％、玉米粉35％、小麦麸15％、豆粕 7％，加适量水，调节水分含量至40％-50％； 发明人针对上述发酵过程中液体种子中乳酸菌含量、液体种子pH及乳酸含量、发 酵液乳酸菌含量、固体发酵饲料中乳酸菌含量进行了相关检测，具体过程和结果如下： 取上述步骤(2)获得的植物乳杆菌发酵液1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养 基中，32℃培养48h后测得产品中活菌含量为2.8*109CFU/mL； 取上述步骤(2)获得的植物乳杆菌发酵液离心测定pH和乳酸含量，pH为3.0-3.5， 乳酸含量为10.0-15.0g/L，优选的控制pH为3.27，乳酸含量为12.3g/L； 4 CN 111593010 A 说 明 书 3/6 页 取上述步骤(4)获得的植物乳杆菌发酵液1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养 基中，32℃培养48h后测得产品中活菌含量为5.2*109CFU/mL； 取上述步骤(5)获得的固体发酵产品1g，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中， 32℃培养48h后进行乳酸菌菌落计数，计算得产品中活菌含量为4.6*109CFU/g；28℃保藏7 天后剩余菌量为2.76*109CFU/g；14d后剩余菌量为1.58*109CFU/g；20d后剩余菌量为1.03* 109CFU/g，存活率23％； 现有技术中的常规乳酸菌固体发酵2d菌量在20-50亿CFU/g左右，本发明所获得的 菌株发酵2d菌量能稳定在45-50亿CFU/g左右，处于较高水平，表明本发明所获得的菌株的 活性较高，发酵性能良好。 根据具体的实验，验证了本发明的有益效果如下： 1、本发明的植物乳杆菌生长速度较快、产酸量高，32℃条件下发酵24h菌量可达到 2.8*109cfu/mL，产酸量可达到12.3g/L； 2、应用本发明的植物乳杆菌制备发酵饲料也就是步骤(5)获得的固体发酵产品， 32℃条件下发酵72h菌量可达到4.5*109cfu/g，其作为饲料直接进行饲喂时可有效抑制发 酵饲料中其他微生物的生长，分解固体培养基中大分子蛋白和脂肪，提高营养水平； 3、应用本发明的植物乳杆菌制备的发酵饲料利于储存，常温密封保藏20d植物乳 杆菌存活率可达到20％以上，较之常规的乳杆菌，本发明所提供的这株菌存活率较高，活性 较高、耐受性强。 保藏信息， 保藏时间：2019年8月20日 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心 保藏编号：CGMCC No.18401 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 分类命名:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲料的方法，所述的植物乳杆菌，菌株代码为YJY19‑08，保藏号为CGMCC No.18401；该菌株具有较强的生长能力和产酸能力，其发酵饲料产品保存时间长、植物乳杆菌存活率高，能够明显提高畜禽采食量、 全部
背景技术：
在饲料中添加抗生素可以提高仔猪生长性能及降低腹泻率和死亡率。目前中国的 养殖场中都普遍使用含有抗生素的饲料添加剂，以达到预防疾病和促进生长的目的。这将 增加动物体内致病性细菌产生耐药性的风险，并使这些耐药细菌和基因传递给人类。2006 年1月1日，欧盟已全面禁止抗生素类添加剂在动物饲料中的应用，其他国家也加大了对抗 生素的使用限制。寻找安全、高效、对环境无污染的替代品是当前急待解决的问题。 发酵饲料可以看作为活菌制剂和发酵底物的复合物，是以植物性农副产品为主要 原料(底物)，通过微生物的代谢作用，降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质，生成有 机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料或饲料 原料。 植物乳酸杆菌属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，利用乳酸菌来发酵饲料，通过饲喂 畜禽发酵饲料，可以维持畜禽肠道内微生态平衡而发挥作用，可以降低养殖室内的氨气、硫 化氢等有害气体的浓度，并且具有防治疾病、增强机体免疫力、提高生长性能、无毒副作用、 无耐药性、无残留、促进生长、增加体重等优点。乳酸菌是我国农业部公布的可直接饲喂动 物且允许使用的饲料级益生菌菌种之一，以其发酵饲料饲喂畜禽具有良好的抗菌性能、稳 定性及对动物和人具有很好的益生作用而被用于畜禽养殖具有广阔的前景。 因此，从自然界筛选出更好的具有降解有机胺类物质功能的菌株成为研究人员的 重要任务之一。
技术实现要素：
本发明针对上述技术存在的不足，提供一株植物乳杆菌及应用该菌株生产发酵饲 料的方法，所述的植物乳杆菌，菌株代码为YJY19-08，保藏号为CGMCC No.18401；该菌株具 有较强的生长能力和产酸能力，其发酵饲料产品保存时间长、植物乳杆菌存活率高，能够明 显提高畜禽采食量、促进营养消化吸收、降低料肉比，具有较高的利用价值。 本发明提供的具体技术方案是： 本发明获得了一株新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其生物保藏编 号为CGMCC No.18401，命名为YJY19-08，其具体获得方法如下： 该菌株是发明人从山东某养猪场厂新鲜粪便中取样，经初筛和复筛得到的一株高 效植物乳杆菌菌株，其筛选过程如下：无菌操作取新鲜猪粪样1g，用无菌生理盐水稀释成 100倍、1000倍的均匀稀释液，取0.1mL稀释液涂布于含有碳酸钙的固体MRS培养基中，35℃ 恒温培养48h，挑选能够产生透明圈的单菌落划线培养，挑选单菌落于甘油培养基中低温保 藏， 3 CN 111593010 A 说 明 书 2/6 页 将低温保藏的菌株接种到200mL液体MRS培养基中，32℃培养48h，检测发酵液中活 菌含量、pH和产酸量；将活力最高、产酸能力最强的乳酸菌菌种送至中国科学院微生物研究 所进行鉴定，根据测序结果，鉴定为植物乳杆菌，该菌株的形态学特征：菌株在固体MRS培养 基呈圆形，菌落较小，边缘整齐，菌体外表面呈乳白色，凸起明亮，培养基内菌落圆扁形。在 显微镜下观察，为杆状，将该菌株送至中国科学院微生物研究所进行16S rDNA测序，该序列 如Seq ID No:1所示，根据测序结果鉴定其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)； 发明人进一步对其进行了生物保藏，生物保藏编号为CGMCC No.18401； 发明人将该菌株进行了相关产酸实验，结果发现该植物乳杆菌生长速度较快、产 酸量高，32℃条件下发酵24h菌量可达到2.8*109CFU/mL，产酸量可达到12.3g/L。 由此，发明人将其应用于生产发酵饲料，分别为制备植物乳杆菌发酵液和制备植 物乳杆菌固体发酵产品： 其中制备植物乳杆菌发酵液的具体步骤如下： (1)菌种活化：取10-30μL冻存的植物乳杆菌接种于含有200mL MRS液体无菌培养 基中，置于28-38℃，160-180rpm振荡培养至对数期； (2)液体种子制备：将活化的菌种200mL转接到含有1000mL MRS液体无菌培养基 中，于28-38℃，160-180rpm振荡培养24h得到液体种子； (3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为 70％的20L种子罐中扩大培养，具体的培养条件为：保持罐温25-28℃，罐压30-40kpa ,搅拌 速率100-120r/min，通气量1：0.2-0.4，pH 3.4-3.6，发酵76-96小时；种子罐中的培养基是 MRS液体无菌培养基； (4)生产罐发酵：将种子液按2-10％v/v的接种量接入装液量为70％的生产罐的培 养基中培养，发酵结束后菌体数量达到5.0*109/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得植 物乳杆菌发酵液； 上述步骤(4)生产罐中的培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸 二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。 上述获得的发酵液可以作为饲料添加剂直接使用，饲喂前将上述发酵液与常规普 通固体饲料按1：9-1：19的重量比例混合后直接饲喂即可； 除此之外，还可以以上述发酵液为起始进行固体发酵获得相应的固体发酵产品， 具体步骤如下： (5)接种与发酵：将获得的植物乳杆菌发酵液按每克0.01-0.1毫升接种到固体培 养基中，混合均匀，25-32℃条件下密封发酵72h，得到固体发酵产品； 上述固体培养基组成按重量百分比为：次粉15％、玉米粉35％、小麦麸15％、豆粕 7％，加适量水，调节水分含量至40％-50％； 发明人针对上述发酵过程中液体种子中乳酸菌含量、液体种子pH及乳酸含量、发 酵液乳酸菌含量、固体发酵饲料中乳酸菌含量进行了相关检测，具体过程和结果如下： 取上述步骤(2)获得的植物乳杆菌发酵液1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养 基中，32℃培养48h后测得产品中活菌含量为2.8*109CFU/mL； 取上述步骤(2)获得的植物乳杆菌发酵液离心测定pH和乳酸含量，pH为3.0-3.5， 乳酸含量为10.0-15.0g/L，优选的控制pH为3.27，乳酸含量为12.3g/L； 4 CN 111593010 A 说 明 书 3/6 页 取上述步骤(4)获得的植物乳杆菌发酵液1mL，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养 基中，32℃培养48h后测得产品中活菌含量为5.2*109CFU/mL； 取上述步骤(5)获得的固体发酵产品1g，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中， 32℃培养48h后进行乳酸菌菌落计数，计算得产品中活菌含量为4.6*109CFU/g；28℃保藏7 天后剩余菌量为2.76*109CFU/g；14d后剩余菌量为1.58*109CFU/g；20d后剩余菌量为1.03* 109CFU/g，存活率23％； 现有技术中的常规乳酸菌固体发酵2d菌量在20-50亿CFU/g左右，本发明所获得的 菌株发酵2d菌量能稳定在45-50亿CFU/g左右，处于较高水平，表明本发明所获得的菌株的 活性较高，发酵性能良好。 根据具体的实验，验证了本发明的有益效果如下： 1、本发明的植物乳杆菌生长速度较快、产酸量高，32℃条件下发酵24h菌量可达到 2.8*109cfu/mL，产酸量可达到12.3g/L； 2、应用本发明的植物乳杆菌制备发酵饲料也就是步骤(5)获得的固体发酵产品， 32℃条件下发酵72h菌量可达到4.5*109cfu/g，其作为饲料直接进行饲喂时可有效抑制发 酵饲料中其他微生物的生长，分解固体培养基中大分子蛋白和脂肪，提高营养水平； 3、应用本发明的植物乳杆菌制备的发酵饲料利于储存，常温密封保藏20d植物乳 杆菌存活率可达到20％以上，较之常规的乳杆菌，本发明所提供的这株菌存活率较高，活性 较高、耐受性强。 保藏信息， 保藏时间：2019年8月20日 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心 保藏编号：CGMCC No.18401 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 分类命名:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
