技术摘要：
本发明涉及一种免疫金标速测卡，应用双抗体夹心免疫层析的原理，同时检测植物样本中的烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）。检测时，首先向加样孔中加入待检样本，如果样本中含有两种病毒或其中的一种，在样本层析移动的过程中，病毒会与金标垫上的胶体金标记的特  全部
背景技术：
烟草花叶病毒（以下简称TMV）为棒状病毒科（Virgaviridae），烟草花叶病毒属 （Tobamovirus）病毒。病毒粒子为螺旋杆状，长300nm，直径18nm，病毒结构极为稳定，基因组 为正单链RNA。TMV寄主植物多达350  余种，侵染烟草等茄科作物会出现明显的花叶和斑驳 症状，并可造成严重的矮化或畸形，对农业生产危害极大。 马铃薯Y病毒（以下简称PVY），为马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属 （Potyvirus）病毒。病毒粒子为线状，基因组为正单链RNA。PVY有多种株系，其中N株系可以 造成烟草等寄主叶脉坏死，严重时可以造成作物绝收。 目前常规检测TMV和PVY的方法为PCR，需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪 器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前 处理复杂，所需时间很长。 以侧向流动为检测原理的金标卡检测方法已在很多领域中有过应用，包括食品安 全检测、植物转基因检测等，但针对烟草病毒的检测较少，而同时检测TMV和PVY等的速测卡 还未见有公开报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服竞争法检测技术的不足，提供一种基于双抗夹心法制备同 时检测TMV和PVY的金标卡检测方法，并应用其针对叶片样品中TMV和PVY进行快速、现场和 灵敏的检测。 本发明是通过以下技术方案实现的：一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病 毒PVY的速测卡，包含：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、NC膜以及吸收垫，所述的金标垫 固定有胶体金标记的TMV单克隆抗体和PVY单克隆抗体，所述的NC膜有两条检测线，分别固 定TMV或PVY特异性多克隆抗体。 所述的TMV单克隆抗体和PVY单克隆抗体分别由分泌TMV单克隆抗体的杂交瘤细胞 株和分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备得到。 所述的在金标垫上固定5ng-50ng两种单克隆抗体，优化的量为TMV单克隆抗体 24ng，PVY单克隆抗体24ng，NC膜上固定0.4μg-1 .2μg两种特异性多克隆抗体，优化的量为 TMV多克隆抗体0.4μg，PVY多克隆抗体0.4μg。 分泌TMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC  NO:C2019177，保藏单  位：CCTCC-中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏日期：2019-9-27，分类  命 名：杂交瘤细胞株FL085-01；分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为  CCTCC  NO: C2019178，保藏单位：CCTCC-中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武  汉，保藏日期： 3 CN 111596062 A 说　明　书 2/4 页 2019-9-27，分类命名：杂交瘤细胞株FL204-46。 还包括封盖板，所述的封盖板设置加样孔和结果观察孔，加样孔对应样品垫的位 置，结果观察孔对应金标垫和NC膜位置。 所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡的制备方法， （1）将TMV和PVY的特异性多克隆抗体和二抗分别固定于NC膜上；（2）在碱性条件下将胶体金 颗粒分别与抗TMV特异性单克隆抗体与抗PVY特异性单克隆抗体通过静电作用力相互结合； （3）速测卡的组装：底板上依次粘贴的样品垫、金标垫、NC膜以及吸收垫，加盖封盖板与底板 合并形成速测卡。 所述的一种同时检测烟草花叶病毒TMV和马铃薯Y病毒PVY的速测卡的使用方法， 首先于加样孔中加入样品溶液并水平放置，样品溶液会沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的 试纸条，并与NC膜上的特异性抗原竞争结合试纸条上固定的特异性单克隆抗体，1min后，于 结果观察孔中观察颜色变化，作出判断；如果只有控制线C线，没有相应的检测线T线，则表 明为待检物质为阴性；既有控制线C线，又有相应的检测线T线，则表明待检物质为阳性。 本发明制得的新型TMV/PVY二合一速测卡对烟草叶片具有较好的抗干扰效果，可 广泛应用于烟草的快速检测。较现有的速测卡操作相比，具有以下特有优势。 （1）同一张卡上能同时检测TMV和PVY，而不是两张单种卡的简单物理性胶连，加样 仅需1次，而且反应均在同一条件下进行。 （2）样品前处理完全统一，操作简单，100微升样品加样量即可。 （3）检测时间短（1  min）、结果判定标准统一。完全阴性结果（仅出现1条C线）；阳性 （＋）：只要任何一条TMV/PVY的T线显色。 本发明提供的同时检测TMV和PVY的二合一免疫胶体金速测卡可为实际检测部门 提供了快速、现场和灵敏的检测方法，主要应用于叶片样品的检测。 附图说明： 图1为本发明结构示意图；1  -结果观察孔；2-C线、控制线；3-TMV线；4-PVY线；5-加样 孔。