技术摘要：
本发明公开了一种合成乳酰N‑新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，本发明的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主基因组上敲除β‑半乳糖苷酶lacZ基因、葡萄糖胺‑6‑磷酸脱氨酶nagB基因、UDP‑乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因、UDP‑葡萄糖脱氢酶ugd基因，并在基因组上过  全部
背景技术：
母乳一直被视为婴幼儿最好的食物来源，除了为婴幼儿提供正常生长所需营养 外，还具有众多牛乳不具有的健康促进效应。寡糖是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固 体组分，母乳中的寡糖总含量为5～15g/L。 乳酰N-新四糖(Lacto-N-neotetraose)是母乳中含量较高的母乳寡糖之一，对于 调节肠道菌群、增强免疫力、促进细胞合成有着重要作用。作为一种重要的营养物质，乳酰 N-新四糖已被美国FDA和EU批准作为添加剂添加到婴幼儿奶粉中。 目前，乳酰N-新四糖可以通过化学合成法和酶合成法生产，但化学合成法存在反 应步骤复杂、原材料价格昂贵等问题，造成生产成本较高不利于工业的大规模合成，且化学 合成中使用的部分有毒试剂，使产品不宜用于食品添加剂，酶合成法存在底物价格昂贵等 缺点。而生物法可以利用廉价碳氮源和底物，实现乳酰N-新四糖的合成，且对环境不造成影 响。因此，通过生物法制备乳酰N-新四糖受到了越来越多的关注。 此前，已有研究通过对微生物进行改造以合成乳酰N-新四糖，包括在大肠杆菌属 和枯草芽孢杆菌属中构建代谢途径，但之前的研究多采用质粒引入关键基因，质粒表达不 够稳定，存在容易在发酵过程中丢失，或发酵产量不稳定等问题。部分研究尝试在基因组上 表达关键基因，但没有对代谢途径进行进一步地调控，造成碳源多流向其他分支途径，代谢 过程中底物利用率低，产物产量难以提高等问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明构建了利用β-1 ,3-N-葡糖氨基酶lgtA基因和β-1 ,4 半乳糖转移酶lgtB基因在大肠杆菌中合成乳酰-N-新四糖的新途径，利用大肠杆菌自身代 谢途径中的UDP-半乳糖，UDP-乙酰氨基葡萄糖作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在 乳糖运输酶的作用下转入细胞，合成乳酰-N-新四糖。 本发明的第一个目的是提供一种合成乳酰N-新四糖的重组大肠杆菌，所述的重组 大肠杆菌是在大肠杆菌宿主基因组上敲除β-半乳糖苷酶lacZ基因、葡萄糖胺-6-磷酸脱氨 酶nagB基因、UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因、UDP-葡萄糖脱氢酶ugd基因，并在基 因组上过表达乳糖运输酶lacY基因、β-1,3-N-葡糖氨基酶lgtA基因和β-1,4半乳糖转移酶 lgtB基因。 进一步地，所述的β-1,3-N-葡糖氨基酶的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1所示。 进一步地，所述的β-1,4半乳糖转移酶得氨基酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 进一步地，所述的β-半乳糖苷酶lacZ基因的ID为945006，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶 nagB基因的ID为945290，UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因的ID为944789，UDP-葡萄 3 CN 111548979 A 说　明　书 2/4 页 糖脱氢酶ugd基因的ID为946571，乳糖运输酶lacY基因的ID为949083。 进一步地，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌MG1655。 进一步地，所述的重组大肠杆菌的β-1 ,3-N-葡糖氨基酶和β-1 ,4半乳糖转移酶的 启动子是tac启动子。 本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤： S1、构建包含β-1,3-N-葡糖氨基酶和β-1,4半乳糖转移酶的重组片段lgtAB-tac； S2、采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，依次敲除大肠杆菌MG1655中lacZ、nagB、 wecB、ugd基因，得到敲除lacZ、nagB、wecB、ugd基因的重组菌； S3、采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，在S2步骤得到的重组菌中过表达lacY基 因，得到过表达lacY基因的重组菌； S4、将重组片段lgtAB-tac转入S3步骤得到的重组菌中，得到所述的重组大肠杆 菌。 本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌在发酵生产乳酰-N-新四糖的应 用。 进一步地，所述的应用具体包括如下步骤：将重组大肠杆菌的种子液以OD值0.1- 0.2的接种量接入发酵培养基中培养至OD达到1.8～2.2时，在28～32℃下，以0.15～0.25mM 的IPTG进行诱导45～50h。 进一步地，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨10～14g/L，酵母提取物22～26g/ L，甘油3～5g/L，磷酸氢二钾2.2～2.5g/L，三水磷酸氢二钾16.2～16.5g/L，乳糖4～6g/L。 本发明的有益效果： 本发明构建了利用β-1,3-N-葡糖氨基酶lgtA基因和β-1,4半乳糖转移酶lgtB基因 在大肠杆菌中合成乳酰-N-新四糖的新途径，利用大肠杆菌自身代谢途径中的UDP-半乳糖， UDP-乙酰氨基葡萄糖作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在乳糖运输酶的作用下转入 细胞，合成乳酰-N-新四糖。本发明的重组大肠杆菌合成乳酰-N-新四糖的产量达到985mg/ L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产乳酰-N-新四糖奠定了基础。 附图说明 图1为本发明重组大肠杆菌合成乳酰-N-新四糖的代谢途径。 图2为本发明重组大肠杆菌合成的乳酰-N-新四糖的液质联用色谱图。 图3为本发明中M0AB、M04AB、M05AB的乳酰-N-新四糖产量比较。