技术摘要：
本发明公开了一种用于生鲜奶品质评价的标记物，所述标记物为天青杀素1。本发明公开了上述标记物在评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况中的应用。本发明公开了上述标记物用于生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况评价的方法，取待测牛奶样品，提取乳清蛋白，对所得乳清蛋白 全部
背景技术：
牛奶中主要营养物质包括蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和糖类等，也含有丰富的 生物活性物质，但其组成受诸多因素的影响，其中奶牛乳腺感染病原菌是最为常见的引起 生鲜奶品质变化的因素。奶牛患上乳房炎后，可直接造成牛奶废弃、产奶量减少、生鲜奶品 质下降、治疗费用增加等经济损失。 监测奶牛健康状况，以确保提供优质牛奶是国内奶牛养殖场的重要工作之一。目 前，奶中体细胞数是评价奶牛乳腺健康和生鲜奶品质最为常用的指标。一般认为，体细胞数 低于20万/mL时为优质奶，该牛奶来源的奶牛健康；体细胞数在20万/mL和50万/mL之间时为 合格奶，该牛奶来源的奶牛较为健康；体细胞数超过50万/mL时，该牛奶来源的奶牛呈临床 型乳房炎。然而，日龄较大、胎次较高的奶牛所产牛奶中体细胞数时有变动，特别是奶牛受 应激时所产牛奶体细胞数会增加，从而影响用体细胞数评价生鲜奶品质的准确性。 此外，目前奶中体细胞数的检测方法有显微镜镜检法、荧光显微镜计数法、加利福 尼亚乳房炎试验(CMT)和高速体细胞计数法(如丹麦的fossmat-ic系列计数仪)等。显微镜 镜检法是测定牛奶体细胞数的标准方法，但制备样品计数、镜检费时费力，不适于现场快 速、大批量样品使用；荧光显微镜计数法的制片、镜检要花费许多时间，不适合于大量、快速 的检测应用；加利福尼亚乳房炎试验(CMT)虽然快速，但不能得到具体的体细胞数，只能划 分出1个大致的数量范围，并且操作者要有丰富的经验，否则容易引起误判；高速体细胞计 数仪售价昂贵，不能普及使用。 基于以上背景乳品行业内亟需一种准确度更高、检测方法更为便捷的新标记物来 评价奶牛乳腺感染状况和生鲜奶品质情况。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于生鲜奶品质 评价的标记物及其应用和评价方法，通过建立天青杀素1与生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染 状况之间的相关性，为科学、准确、简便评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况提供新依 据。 一种用于评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况的标记物，所述标记物为天青 杀素1。 一种上述标记物在评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况中的应用。 一种上述标记物用于生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况评价的方法，取待测牛 奶样品，提取乳清蛋白，对所得乳清蛋白进行酶解，然后采用液相色谱串联质谱法检测其中 所述标记物的含量以判断生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况。 3 CN 111551657 A 说 明 书 2/6 页 优选地，当天青杀素1的相对含量小于等于106，则奶牛健康，生鲜奶品质优；当天 青杀素1的相对含量大于106小于等于107，则奶牛可能患有隐性乳房炎，生鲜奶品质合格；当 天青杀素1的相对含量大于107，则奶牛患有乳房炎，生鲜奶品质不合格。 优选地，液相色谱串联质谱法检测的具体操作如下：采用质量分数为0.1％的甲酸 溶液溶解酶解肽段，然后注入液相色谱仪进行测定，色谱流出液注入质谱仪进行质谱检测。 优选地，液相色谱条件如下：以质量分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以质量 分数为0.1％的甲酸水溶液与乙腈按体积比为5：95混合液为流动相B，流速为300nL/min，梯 度洗脱，进样量为5-10μL。 优选地，梯度洗脱具体如下： 时间(min) 流动相B浓度(％) 0 3 2 5 37 25 45 45 48 90 60 90 优选地，质谱检测条件如下：喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens 射频为55％；全扫描范围为300-2000m/z，全扫描分辨率为30000@m/z400，离子最大注入时 间为200ms，AGC为1E6，碰撞能量为30％；二级扫描分辨率为15000@m/z400，离子最大注入时 间为100ms，AGC为1E4。 优选地，将所得质谱原始RAW文件使用软件Skyline 4.1数据提取分析。根据目标 肽段的峰面积定量分析，进一步计算得到目标蛋白在不同样品比较组中的相对表达量差 异。 优选地，待测牛奶样品乳清蛋白提取的具体步骤如下：取待测牛奶样品，在2500- 4000×g，4-6℃条件下离心15-40min，收集中间乳清层，调节乳清的pH值至4.6，然后在 10000-15000×g，4-6℃条件下离心10-30min，收集上层清液，得到乳清蛋白。 优选地，对所得乳清蛋白进行酶解的具体操作如下：向所得乳清蛋白中加入浓度 为50-100mmol/L的二硫苏糖醇，再加入浓度为50-100mmol/L碘乙酰胺溶液，室温避光，接着 加入胰蛋白酶溶液，乳清蛋白与胰蛋白酶质量比为25-80：1，37℃孵育过夜，再加入甲酸溶 液，接着12000-14000×g，离心20-40min，取上层液进行干燥得到酶解肽段。 现有技术中体细胞数受影响因素较多，奶牛受应激时体细胞数会增加，导致评价 不准确。本领域技术人员也发现奶中急性期蛋白包括结合珠蛋白、血清淀粉样蛋白A和α酸 性糖蛋白以及抗菌肽含量与乳腺感染存在显著的正相关，可作为监测奶牛乳腺感染的标记 分子；但是牛奶中也存在一定量的急性期蛋白和抗菌肽，阻碍了判定结果的准确性。 而牛奶中天青杀素1主要来源于多形核白细胞，由白细胞裂解释放，参与宿主防 御，用于杀灭侵入的病原微生物，能够准确反映奶牛炎症情况，因此作为标记物更准确，但 缺少更多的研究。 本发明提供一种评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况的标记物——天青杀素 1，能够用于评判生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况，结果更加准确可靠，弥补了依据体细 4 CN 111551657 A 说 明 书 3/6 页 胞数评判时的不准确性，同时检测步骤简便、准确，可为牧场防控奶牛乳腺感染，生产优质 牛奶提供科学的评判依据。
本发明公开了一种用于生鲜奶品质评价的标记物，所述标记物为天青杀素1。本发明公开了上述标记物在评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况中的应用。本发明公开了上述标记物用于生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况评价的方法，取待测牛奶样品，提取乳清蛋白，对所得乳清蛋白 全部
背景技术：
牛奶中主要营养物质包括蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和糖类等，也含有丰富的 生物活性物质，但其组成受诸多因素的影响，其中奶牛乳腺感染病原菌是最为常见的引起 生鲜奶品质变化的因素。奶牛患上乳房炎后，可直接造成牛奶废弃、产奶量减少、生鲜奶品 质下降、治疗费用增加等经济损失。 监测奶牛健康状况，以确保提供优质牛奶是国内奶牛养殖场的重要工作之一。目 前，奶中体细胞数是评价奶牛乳腺健康和生鲜奶品质最为常用的指标。一般认为，体细胞数 低于20万/mL时为优质奶，该牛奶来源的奶牛健康；体细胞数在20万/mL和50万/mL之间时为 合格奶，该牛奶来源的奶牛较为健康；体细胞数超过50万/mL时，该牛奶来源的奶牛呈临床 型乳房炎。然而，日龄较大、胎次较高的奶牛所产牛奶中体细胞数时有变动，特别是奶牛受 应激时所产牛奶体细胞数会增加，从而影响用体细胞数评价生鲜奶品质的准确性。 此外，目前奶中体细胞数的检测方法有显微镜镜检法、荧光显微镜计数法、加利福 尼亚乳房炎试验(CMT)和高速体细胞计数法(如丹麦的fossmat-ic系列计数仪)等。显微镜 镜检法是测定牛奶体细胞数的标准方法，但制备样品计数、镜检费时费力，不适于现场快 速、大批量样品使用；荧光显微镜计数法的制片、镜检要花费许多时间，不适合于大量、快速 的检测应用；加利福尼亚乳房炎试验(CMT)虽然快速，但不能得到具体的体细胞数，只能划 分出1个大致的数量范围，并且操作者要有丰富的经验，否则容易引起误判；高速体细胞计 数仪售价昂贵，不能普及使用。 基于以上背景乳品行业内亟需一种准确度更高、检测方法更为便捷的新标记物来 评价奶牛乳腺感染状况和生鲜奶品质情况。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于生鲜奶品质 评价的标记物及其应用和评价方法，通过建立天青杀素1与生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染 状况之间的相关性，为科学、准确、简便评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况提供新依 据。 一种用于评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况的标记物，所述标记物为天青 杀素1。 一种上述标记物在评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况中的应用。 一种上述标记物用于生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况评价的方法，取待测牛 奶样品，提取乳清蛋白，对所得乳清蛋白进行酶解，然后采用液相色谱串联质谱法检测其中 所述标记物的含量以判断生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况。 3 CN 111551657 A 说 明 书 2/6 页 优选地，当天青杀素1的相对含量小于等于106，则奶牛健康，生鲜奶品质优；当天 青杀素1的相对含量大于106小于等于107，则奶牛可能患有隐性乳房炎，生鲜奶品质合格；当 天青杀素1的相对含量大于107，则奶牛患有乳房炎，生鲜奶品质不合格。 优选地，液相色谱串联质谱法检测的具体操作如下：采用质量分数为0.1％的甲酸 溶液溶解酶解肽段，然后注入液相色谱仪进行测定，色谱流出液注入质谱仪进行质谱检测。 优选地，液相色谱条件如下：以质量分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以质量 分数为0.1％的甲酸水溶液与乙腈按体积比为5：95混合液为流动相B，流速为300nL/min，梯 度洗脱，进样量为5-10μL。 优选地，梯度洗脱具体如下： 时间(min) 流动相B浓度(％) 0 3 2 5 37 25 45 45 48 90 60 90 优选地，质谱检测条件如下：喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens 射频为55％；全扫描范围为300-2000m/z，全扫描分辨率为30000@m/z400，离子最大注入时 间为200ms，AGC为1E6，碰撞能量为30％；二级扫描分辨率为15000@m/z400，离子最大注入时 间为100ms，AGC为1E4。 优选地，将所得质谱原始RAW文件使用软件Skyline 4.1数据提取分析。根据目标 肽段的峰面积定量分析，进一步计算得到目标蛋白在不同样品比较组中的相对表达量差 异。 优选地，待测牛奶样品乳清蛋白提取的具体步骤如下：取待测牛奶样品，在2500- 4000×g，4-6℃条件下离心15-40min，收集中间乳清层，调节乳清的pH值至4.6，然后在 10000-15000×g，4-6℃条件下离心10-30min，收集上层清液，得到乳清蛋白。 优选地，对所得乳清蛋白进行酶解的具体操作如下：向所得乳清蛋白中加入浓度 为50-100mmol/L的二硫苏糖醇，再加入浓度为50-100mmol/L碘乙酰胺溶液，室温避光，接着 加入胰蛋白酶溶液，乳清蛋白与胰蛋白酶质量比为25-80：1，37℃孵育过夜，再加入甲酸溶 液，接着12000-14000×g，离心20-40min，取上层液进行干燥得到酶解肽段。 现有技术中体细胞数受影响因素较多，奶牛受应激时体细胞数会增加，导致评价 不准确。本领域技术人员也发现奶中急性期蛋白包括结合珠蛋白、血清淀粉样蛋白A和α酸 性糖蛋白以及抗菌肽含量与乳腺感染存在显著的正相关，可作为监测奶牛乳腺感染的标记 分子；但是牛奶中也存在一定量的急性期蛋白和抗菌肽，阻碍了判定结果的准确性。 而牛奶中天青杀素1主要来源于多形核白细胞，由白细胞裂解释放，参与宿主防 御，用于杀灭侵入的病原微生物，能够准确反映奶牛炎症情况，因此作为标记物更准确，但 缺少更多的研究。 本发明提供一种评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况的标记物——天青杀素 1，能够用于评判生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况，结果更加准确可靠，弥补了依据体细 4 CN 111551657 A 说 明 书 3/6 页 胞数评判时的不准确性，同时检测步骤简便、准确，可为牧场防控奶牛乳腺感染，生产优质 牛奶提供科学的评判依据。
