技术摘要：
本发明涉及一种高灵敏度、多种分子同时检测、自动化微流体检测的基于介电泳的蛋白质富集方法及多生物探针快速检测系统，本发明由于特定的电极结构以及2层纳米棒对电场的影响，增强了电场的不均匀度，使得其拥有更低的最小检测极限值，实现高灵敏度的生物分子检测；通过  全部
背景技术：
生物检测领域通常需要针对少量、低浓度的样品进行操作。样品的高效富集可有 效减少样品使用量，降低检出限，对于疾病早期诊断、食品安全、环境污染检测等具有重要 意义。陈文学等利用生物素亲和素将适配子结合到微流控反应室内进行细胞捕获，杨柯利 用微流控芯片产生的浓度梯度从全血中筛选和富集了中性粒细胞，杜敏等利用微流控芯片 和免疫探针芯片相结合的方法完成了免疫样品的富集。上述文献中，都成功对生物分子进 行了富集，但是仍存在一些不足之处。首先，这些检测芯片需要机械部件(微泵、微阀等)进 行驱动，增加了与测定部件和进样部件集成的复杂度。其次，这些检测芯片的结构大都比较 复杂，加工成本比较高。本发明具有结构简单、制作简便而且无需额外的机械部件等优点。 在生物检测和临床诊断等领域都有广泛的应用价值。 生物分子的富集在生物学研究和临床诊断中有着重要作用。通常细胞可以通过离 心等方法有效的富集，而DNA通过PCR放大来富集，蛋白质是生命活动中重要的化学物质，比 如酶催化生物体中很多生化反应，抗体在免疫中起到重要作用，一些蛋白质参与细胞信号 传导、细胞周期调控、新陈代谢等。对于蛋白质来说，目前缺少非常有效的生化富集方法。通 过蛋白质的富集，能够有效提高检测的灵敏度，对目标分子进行高效的分析。 将溶液中的颗粒富集到固体表面有多种方法，例如：采用介电泳技术，可以将标记 生物分子的绝缘体颗粒富集到金属电极表面；采用激光辅助电泳技术；采用磁场辅助介电 泳技术。 介电泳通过非均匀电场对粒子的极化实现分子的操控。介电泳的力与分子直径的 三次方成正比，与电场平方的梯度成正比。由于蛋白质的分子量非常小，分子直径较小，因 而介电泳的力较小，通常的方法是通过提高电压来实现有效的富集。然而高电压会存在电 化学反应和电极失效(electrode  fouling)等缺点。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提出一种基于介电泳效应的蛋白质富集方法，使用锯 齿状结构和梯形结构，首先实现较强的非均匀电场，并且同时在检测区域生长多层纳米棒 结构，极大地提高该区域电场梯度及介电泳力，从而在很低的电压下实现高性能蛋白质富 集。同时本发明提出一种基于该方法的多生物探针快速检测系统，在芯片不同检测区域固 定不同的捕获抗体(Capture  Antibody)，能够实现对于不同生物标志物的并行化检测。 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种基于介电泳的蛋白质富集方法，使用锯齿状检测电极结构和/或梯形检测电 3 CN 111569962 A 说　明　书 2/6 页 极结构，实现较强的非均匀电场，并且在检测区域生长多层纳米棒结构，实现对蛋白质的低 电压富集。 介电泳效应是指电介质在非均匀电场中由于极化效应所产生的的位移现象，这种 现象只与粒子和所处环境的电学性质和外加电场的梯度相关，介电泳力的表达式如下： 其中r是电介质粒子的半径，E是外加电场的电场强度，K是与粒子和环境的电学性 质相关的常数，εp是粒子的复介电常数，εm是所处环境的复介电常数。当外加电场不均匀时， 产生的诱导偶极矩会与电场相互作用形成介电泳力，使得粒子向电场强度较大或较小的方 向移动。其中基于绝缘体的介电泳效应(iDEP)可以很好地处理小尺度范围内的粒子，且生 物相容性较好，其具体原理就是电场在绝缘体和环境中共同形成一个不均匀的电场，实现 介电泳效应，然而这种方式形成介电泳力通常需要的电压较高。 进一步的，所述的电极结构是通过lift-off工艺制备的。用SU8光刻胶制备出相应 的形状，后使用蒸镀设备分别蒸镀一层钛和金，随后使用丙酮去除光刻胶，这时光刻胶上面 的钛和金层也会一并移去，从而留下所需的金电极结构。 进一步的，所述的多层纳米棒是通过OAD的方法制备的，通过多次OAD和一次正面 的蒸镀制得：第一次通过OAD方法生长出高度为200nm的二氧化硅纳米棒，然后将沉积源换 为银，沿着二氧化硅纳米棒生长高度为300nm的银纳米棒，最后正面蒸镀一层二氧化硅层， 一方面增强介电泳效应，起到绝缘效果，同时方便后续的等离子体键合。 一种基于介电泳的蛋白质富集方法的多生物探针快速检测系统，包括基板、进样 口、出样口、检测电极、接线电极、纳米棒检测区域与提供反应溶液流动的沟道；接线电极与 电源相连提供了检测区域的电信号；检测电极位于接线电极相对的端部。 进一步的，所述检测系统的制备方法是将已经蒸镀了电极和多层纳米棒的硅片与 通过倒模方式形成沟道的聚二甲基硅氧烷PDMS键合。 进一步的，所述接线电极包括多个电极组，该电极组由一一对应的正电极与负电 极组成。 见图4，其中结构1可以提供在不同区域毫无干扰的检测，但是不能在同一个显微 镜视野中观察到所有的变化。结构2和结构3都可以在一个显微镜视野下观察多个蛋白质反 应的情况，其中结构2可以同时观察2组，结构3可以观察4组。 进一步的，所述正电极与负电极均为L形，L的长端端部相对处设置检测电极，形成 4个检测区域。 进一步的，所述正电极与负电极分别为一长一短的L形，相同朝向的L的上下面相 邻处设置检测电极，形成4个检测区域。 进一步的，所述正电极与负电极的形状相同，一端的端部带有尖角，正电极与负电 极尖角相邻处设置检测电极，多个电极组形成米字型。 进一步的，把带有不同捕获抗体的混合液一起注入沟道，然后在不同的检测区域 的电极上施加不同的电压信号，由于不同抗体产生介电泳效应的电压频率不同，使得不同 4 CN 111569962 A 说　明　书 3/6 页 检测区域富集不同的捕获抗体； 或者分批通入低浓度的捕获抗体溶液，每次在不同的检测区域施加相应的电压信 号，每个检测区域富集相应的捕获抗体。 本发明是基于多层纳米棒的介电泳效应，这种结构在极化的绝缘体里面还存在一 个导体(银)，而导体电荷都分布在其表面，从而一定程度上使得绝缘体内部电场不均匀度 增加，这样也会影响外边电场的分布，同样提高了外部电场的不均匀度。这一结构的提出一 方面在较低电压下同样可以形成介电泳效应吸引蛋白质分子，另一方面极大地提高了蛋白 质富集的程度，可以检测更低浓度的生物分子。 本发明具有以下的有益效果： (1)检测的高灵敏度：本发明中由于特定的电极结构以及2层纳米棒对电场的影 响，增强了电场的不均匀度，使得其拥有更低的最小检测极限值，实现高灵敏度的生物分子 检测； (2)多种分子同时检测：本发明通过在不同检测区域内键合不同的生物分子，然后 用这些特定的生物分子去检测，本发明有4个检测区域，可以检测四种生物分子，一次性检 测多种生物分子，一定程度上节约样品与时间，提高检测效率。 (3)自动化微流体检测：本发明使用微流控技术，通过沟道进样，由于沟道尺寸较 小(50μm高)，从而所需样品量少(0.1mL)，进样简单。 附图说明 图1是本发明的一种结构示意图； 图2是本发明的侧视图； 图3是本发明检测电极的结构示意图； 图4是本发明接线电极的结构示意图； 图5是本发明的检测示意图； 图6是多层纳米棒的制备流程图； 图7是本发明电极的制备流程图； 图8是本发明的检测系统的制备流程图。 图中，1.基板；2.进样口；3.接线电极；4.检测电极；5.出样口；6.沟道。