技术摘要：
本发明涉及分子生物学领域，具体公开一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，设计了两对特异性引物，同时根据绵羊的编码肌形成蛋白(myogenin)基因设计两对内标性引物，采用多重巢式PCR检测法并结合RAPD反应体系，解决了由于胚胎丢失或胚胎细胞量太少而造成假阴性判断，提供 全部
背景技术：
人为控制家畜出生后代的性别比例, 对畜牧业的发展和遗传育种工作具有重要 的经济意义, 特别是对于那些具有明显性别生产性能和饲养经济效益，差异的物种. 通过 人为手段控制后代性别, 可以满足不同畜种不同性别的特殊生产需要, 能够极显著地提 高养殖业的经济效益, 具有广阔的应用前景. 过去有人曾尝试过各种方法, 如H - Y 抗 体法、FISH法、流式细胞仪分离XY 精子法等性别控制方法, 虽然这些方法在某些方面取得 了一定的成功, 但在现场应用方面还存在诸多的困难和不便之处. 利用PCR 技术扩增Y 染色体特异序列进行胚胎的性别鉴定, 能够用较少的时间取得 较高的可靠性, 准确率可达95%～100%. 目前, PCR 技术在牛、羊早期胚胎性别鉴定中已 取得了突破性的进展, Herr于1990 年首先采用PCR 技术扩增Y 染色体特异多重复序列来 鉴定牛、羊的胚胎性别, 准确率分别达到91 .6 %和96 .5%;同时Sinclair ,Gubbay和 Koopman也都先后发现了哺乳动物的性别决定基因SRY , 通过PCR 技术来检测SRY 基因的 有无便可判定胚胎的性别. 国内学者曾溢涛等通过PCR 技术鉴定奶牛胚胎性别获得成功, 但在现场应用中还存在一定的困难，胚胎丢失或胚胎细胞量太少等因素会造成假阴性判 断。因此,研究出一种准确性高、灵敏度好、鉴定时间短的PCR 技术势在必行。 RAPD(random amplified polymorphic DNA）即随机扩增多态性DNA标记，是由美 国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这 样的一个推理：对于不同模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱，也可能得到不 同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因 组DNA总是具有一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩 增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产 生的扩增条带数也越多。RAPD 分析所需的DNA 样品量极少，对于生物早期取样鉴定或在 DNA 受限制的情况下是十分有利，RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析 及进化关系的研究上，在动物早期胚胎性别鉴定方面的研究鲜有报道，特别是针对羊早期 胚胎性别鉴定方面目前还未有报道。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种一种羊早期胚胎性别鉴定的特异性PCR扩增引物。 本发明的另一个目的是提供一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，设计了两对特 异性引物，同时根据绵羊的编码肌形成蛋白(myogenin)基因设计两对内标性引物，采用多 重巢式PCR检测法并结合RAPD反应体系，解决了由于胚胎丢失或胚胎细胞量太少而造成假 阴性判断，提供了一种准确性更高、灵敏度更好、鉴定时间短的PCR 技术。 为达到上述发明目的，本发明提供的具体方案如下： 3 CN 111575387 A 说 明 书 2/5 页 一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的引物，包含A1和A2两对特异性引物，其中A1的引物序 列为上游：5-AAAAGGCTTACAGATGCTG-3，下游：5-CTGCTGTGATGCTCCTTT-3，产物大小302 bp； A2的引物序列为上游：5-AAGCGCCCATTCTTTGAG-3，下游：5- TTGGCTTTCCATTTGTGAGT-3，产物 大小219 bp。 进一步地，除了含有上述A1和A2两对特异性引物，还包括B1和B2两对内标引物，其 中B1的引物序列为上游5-CGTGGGCGTGTAAGGTGT-3，下游：5-CAGGCGCTCTATGTACTGGAT-3，产 物大小197 bp；B2的引物序列为上游：5-AGGAAGTCGGTGTCTGTGGA-3，下游：5- ACTTTGGGCAGCCTCTGG-3，产物大小134 bp。 本发明还提供了一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，包括以下步骤: （1）胚胎的获取； （2）DNA的提取； （3）使用权利要求2所述的引物和步骤（2）提取的DNA，进行RAPD反应体系的配置获得 RAPD试剂； （4）PCR扩增反应：将步骤3配置得到的RAPD试剂加入EP管中，轻混后,进行第一轮扩增 反应, 94 ℃变性 3 min , 94 ℃变性 20 s, 58 ℃退火 20 s, 72 ℃延伸 20 s, 共 20 个循环;70 ℃延伸 1 min , 4 ℃ 保存,然后用100чL灭菌石蜡油覆盖于反应混合液之上， 放入仪器，进行第二轮扩增反应, 94摄氏度预变性3min，74摄氏度退火30s，72摄氏度廷伸 30s，退火温度74-60℃，每循环一次减1℃，13个循环后以60℃为退火温度进行扩増； （5）扩增产物的电泳检测； （6）鉴定胚胎的性别判定：凝胶成像系统中扩增条带如显示条302bp的带的则为雄性， 如无则为雌性。 进一步地，步骤（3）中RAPD反应体系的配置为：标准10×PCR缓冲液2.5μL,Mg2 终 浓度为1.5mmol/L；2.5mmol/L的四种脱氧核苷酸混合液2μL,每种脱氧核苷酸混合液终浓度 为200μmol/L；每对引物中的前、后引物各加入1μL；基因组DNA5μL； Tag DNA聚合酶0.25μL； 以无菌去离子蒸馏水补充体积至25μL。 不同的引物具有其特定的退火温度，这直接影响着扩增的效果，对于PCR 反应中 各成分浓度而言也是如此，Mg2 浓度、dNTPs 浓度、引物浓度是体系调整优化的关键所在， 在buffer 中不含Mg2 时，Mg2 浓度的调节很重要，引物浓度是最重要的调整量，不但DNA模 板的浓度决定引物的终浓度，而且引物自身不同的扩增效率也影响反应引物终浓度的确 定。 进一步地，步骤（5）扩增产物的电泳检测包括取1mL的6 x loading buffer和5mL 的PCR扩增产物加入已经做好的2％的 agarose凝胶样孔中，100V电压电泳30min，溴化乙啶 (EB)染色10min。 进一步地本发明还提供了一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的PCR试剂盒，采用上述 的两对围绕Y-染色体上的性别决定基因序列进行设计的特异性引物对，或者添加了内标引 物的PCR试剂盒，试剂盒中除了引物外的其他成分，都可以根据现有技术进行设计添加。 进一步地，试剂盒包含本发明所述的RAPD反应体系。 RAPD 技术以一系列随机引物对基因组进行检测，因而能检测多个基因位点，覆盖 率比较大，并且引物越多，覆盖面越广，遗传信息也随之增加，使用RAPD反应体系，结合多重 4 CN 111575387 A 说 明 书 3/5 页 巢式PCR提高了检测的准确性，准确度可以达到99%以上。 本发明设计的引物对，采用了多重巢式PCR技术和RAPD 技术相结合，并通过试验 设定了特定的反应体系参数，避免了由于胚胎丢失或胚胎细胞量太少而造成假阴性判断, 试验设计了一对常染色体引物作为内标引物和特异性基因引物同时进行扩增。试验中内标 引物的扩增效率比特异性引物高，因此扩增结果中可以看到清晰的内标引物扩增带，但SRY 基因序列片段扩增带较弱；对于细胞数较少的胚胎样品而言，几乎看不到这条带，采用RAPD 反应体系扩增方法提高特异性引物的扩增效率，可同时看到内标引物扩增产物带和更清晰 的SRY 基因引物扩增产物带，极大的提高鉴定的准确率。
本发明涉及分子生物学领域，具体公开一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，设计了两对特异性引物，同时根据绵羊的编码肌形成蛋白(myogenin)基因设计两对内标性引物，采用多重巢式PCR检测法并结合RAPD反应体系，解决了由于胚胎丢失或胚胎细胞量太少而造成假阴性判断，提供 全部
背景技术：
人为控制家畜出生后代的性别比例, 对畜牧业的发展和遗传育种工作具有重要 的经济意义, 特别是对于那些具有明显性别生产性能和饲养经济效益，差异的物种. 通过 人为手段控制后代性别, 可以满足不同畜种不同性别的特殊生产需要, 能够极显著地提 高养殖业的经济效益, 具有广阔的应用前景. 过去有人曾尝试过各种方法, 如H - Y 抗 体法、FISH法、流式细胞仪分离XY 精子法等性别控制方法, 虽然这些方法在某些方面取得 了一定的成功, 但在现场应用方面还存在诸多的困难和不便之处. 利用PCR 技术扩增Y 染色体特异序列进行胚胎的性别鉴定, 能够用较少的时间取得 较高的可靠性, 准确率可达95%～100%. 目前, PCR 技术在牛、羊早期胚胎性别鉴定中已 取得了突破性的进展, Herr于1990 年首先采用PCR 技术扩增Y 染色体特异多重复序列来 鉴定牛、羊的胚胎性别, 准确率分别达到91 .6 %和96 .5%;同时Sinclair ,Gubbay和 Koopman也都先后发现了哺乳动物的性别决定基因SRY , 通过PCR 技术来检测SRY 基因的 有无便可判定胚胎的性别. 国内学者曾溢涛等通过PCR 技术鉴定奶牛胚胎性别获得成功, 但在现场应用中还存在一定的困难，胚胎丢失或胚胎细胞量太少等因素会造成假阴性判 断。因此,研究出一种准确性高、灵敏度好、鉴定时间短的PCR 技术势在必行。 RAPD(random amplified polymorphic DNA）即随机扩增多态性DNA标记，是由美 国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这 样的一个推理：对于不同模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱，也可能得到不 同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因 组DNA总是具有一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩 增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产 生的扩增条带数也越多。RAPD 分析所需的DNA 样品量极少，对于生物早期取样鉴定或在 DNA 受限制的情况下是十分有利，RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析 及进化关系的研究上，在动物早期胚胎性别鉴定方面的研究鲜有报道，特别是针对羊早期 胚胎性别鉴定方面目前还未有报道。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种一种羊早期胚胎性别鉴定的特异性PCR扩增引物。 本发明的另一个目的是提供一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，设计了两对特 异性引物，同时根据绵羊的编码肌形成蛋白(myogenin)基因设计两对内标性引物，采用多 重巢式PCR检测法并结合RAPD反应体系，解决了由于胚胎丢失或胚胎细胞量太少而造成假 阴性判断，提供了一种准确性更高、灵敏度更好、鉴定时间短的PCR 技术。 为达到上述发明目的，本发明提供的具体方案如下： 3 CN 111575387 A 说 明 书 2/5 页 一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的引物，包含A1和A2两对特异性引物，其中A1的引物序 列为上游：5-AAAAGGCTTACAGATGCTG-3，下游：5-CTGCTGTGATGCTCCTTT-3，产物大小302 bp； A2的引物序列为上游：5-AAGCGCCCATTCTTTGAG-3，下游：5- TTGGCTTTCCATTTGTGAGT-3，产物 大小219 bp。 进一步地，除了含有上述A1和A2两对特异性引物，还包括B1和B2两对内标引物，其 中B1的引物序列为上游5-CGTGGGCGTGTAAGGTGT-3，下游：5-CAGGCGCTCTATGTACTGGAT-3，产 物大小197 bp；B2的引物序列为上游：5-AGGAAGTCGGTGTCTGTGGA-3，下游：5- ACTTTGGGCAGCCTCTGG-3，产物大小134 bp。 本发明还提供了一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的方法，包括以下步骤: （1）胚胎的获取； （2）DNA的提取； （3）使用权利要求2所述的引物和步骤（2）提取的DNA，进行RAPD反应体系的配置获得 RAPD试剂； （4）PCR扩增反应：将步骤3配置得到的RAPD试剂加入EP管中，轻混后,进行第一轮扩增 反应, 94 ℃变性 3 min , 94 ℃变性 20 s, 58 ℃退火 20 s, 72 ℃延伸 20 s, 共 20 个循环;70 ℃延伸 1 min , 4 ℃ 保存,然后用100чL灭菌石蜡油覆盖于反应混合液之上， 放入仪器，进行第二轮扩增反应, 94摄氏度预变性3min，74摄氏度退火30s，72摄氏度廷伸 30s，退火温度74-60℃，每循环一次减1℃，13个循环后以60℃为退火温度进行扩増； （5）扩增产物的电泳检测； （6）鉴定胚胎的性别判定：凝胶成像系统中扩增条带如显示条302bp的带的则为雄性， 如无则为雌性。 进一步地，步骤（3）中RAPD反应体系的配置为：标准10×PCR缓冲液2.5μL,Mg2 终 浓度为1.5mmol/L；2.5mmol/L的四种脱氧核苷酸混合液2μL,每种脱氧核苷酸混合液终浓度 为200μmol/L；每对引物中的前、后引物各加入1μL；基因组DNA5μL； Tag DNA聚合酶0.25μL； 以无菌去离子蒸馏水补充体积至25μL。 不同的引物具有其特定的退火温度，这直接影响着扩增的效果，对于PCR 反应中 各成分浓度而言也是如此，Mg2 浓度、dNTPs 浓度、引物浓度是体系调整优化的关键所在， 在buffer 中不含Mg2 时，Mg2 浓度的调节很重要，引物浓度是最重要的调整量，不但DNA模 板的浓度决定引物的终浓度，而且引物自身不同的扩增效率也影响反应引物终浓度的确 定。 进一步地，步骤（5）扩增产物的电泳检测包括取1mL的6 x loading buffer和5mL 的PCR扩增产物加入已经做好的2％的 agarose凝胶样孔中，100V电压电泳30min，溴化乙啶 (EB)染色10min。 进一步地本发明还提供了一种杜泊羊早期胚胎性别鉴定的PCR试剂盒，采用上述 的两对围绕Y-染色体上的性别决定基因序列进行设计的特异性引物对，或者添加了内标引 物的PCR试剂盒，试剂盒中除了引物外的其他成分，都可以根据现有技术进行设计添加。 进一步地，试剂盒包含本发明所述的RAPD反应体系。 RAPD 技术以一系列随机引物对基因组进行检测，因而能检测多个基因位点，覆盖 率比较大，并且引物越多，覆盖面越广，遗传信息也随之增加，使用RAPD反应体系，结合多重 4 CN 111575387 A 说 明 书 3/5 页 巢式PCR提高了检测的准确性，准确度可以达到99%以上。 本发明设计的引物对，采用了多重巢式PCR技术和RAPD 技术相结合，并通过试验 设定了特定的反应体系参数，避免了由于胚胎丢失或胚胎细胞量太少而造成假阴性判断, 试验设计了一对常染色体引物作为内标引物和特异性基因引物同时进行扩增。试验中内标 引物的扩增效率比特异性引物高，因此扩增结果中可以看到清晰的内标引物扩增带，但SRY 基因序列片段扩增带较弱；对于细胞数较少的胚胎样品而言，几乎看不到这条带，采用RAPD 反应体系扩增方法提高特异性引物的扩增效率，可同时看到内标引物扩增产物带和更清晰 的SRY 基因引物扩增产物带，极大的提高鉴定的准确率。
