技术摘要：
本发明通过诱变得到了一种转谷氨酰胺酶生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020147或者CCTCC NO:M 2020148。本发明的转谷氨酰胺酶生产菌比原始菌株的转谷氨酰胺酶产酶量提高了4倍多，酶活达到7.5U/mL以上，能够工业化应用。
背景技术：
转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13，Transglutaminase，TGase)又称谷氨酰胺酶转氨酶 (Glutamine transaminase)，简称TG酶，是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性 中心的单体蛋白质，在自然界中广泛存在于人体、高级动物、鱼类、植物和微生物中，例如大 量存在于哺乳动物的各种组织器官(如肝脏、毛囊、表皮、前列腺、血液)。它是一种酰基转移 酶，可通过催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羟酰胺基之间的结合反应(参见 图1)，使蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联。作为一种通过转谷氨酰胺作用形 成共价化合物的聚合酶，借助于两个蛋白质(包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋 白和家禽类肌动球蛋白等)之间的交联反应，提高蛋白质的水溶性、起泡性、可搅拌性、热稳 定性、乳化性等的功能特性。TG酶被称为“21世纪的超级粘合剂”，在食品、医药、纺织、化妆 品等领域应用前景广阔。 在食品领域，该酶能通过引入赖氨酸而提高蛋白质的营养效价，而被其处理过的 食品具有良好的外观和质构，可延长货架期，减少食品中的过敏源。此外，该酶可分解谷氨 酰胺生成谷氨酸和氨，而谷氨酸在食品美味上起着重要作用，因此通过添加该酶可增强食 品的风味。 传统肉类加工工艺通常加入大量的盐和磷酸，以提高其持水力、连贯性和质地。近 些年来，少盐少磷酸的食物被广泛推广，但其质地和物理性质都不尽如人意。TG酶可以替代 部分通常肉制品加工中添加的品质改良剂--磷酸盐，生产低盐肉制品。可应用于水产加工 品、火腿、香肠、面类、豆腐等等。TG酶在40～45℃、pH6-7的条件下，只需添加0.1-0.3％的 量，即可达到明显的效果。 转谷氨酰胺酶主要通过微生物发酵法进行生产，所用的微生物是茂原链霉菌 (Streptomyces mobaraense或Streptomyces mobaraensis)，是我国《食品安全国家标准食 品添加剂使用标准》(GB2760)中唯一合法生产转谷氨酰胺酶的安全菌株。 但目前使用的茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶生产能力偏低，导致发酵液中的酶含量 偏低，因此亟需提高菌株的产酶能力。
技术实现要素：
为了现有转谷氨酰胺酶生产菌株发酵水平低的缺陷，本发明结合化学诱变、物理 诱变和杂交育种来筛选茂原链霉菌突变菌株，获得了高产转谷氨酰胺转氨酶的生产菌株。 因此，本发明的第一个目的在于提供一种转谷氨酰胺酶生产菌。 本发明的第二个目的在于提供上述转谷氨酰胺酶生产菌用于生产转谷氨酰胺酶 的应用。 为了达到上述目的，本发明对于上海东之汇生物科技有限公司所保藏的茂原链霉 3 CN 111593011 A 说 明 书 2/6 页 菌DSM40587设计了如下诱变筛选方案： 1)活化原始菌株茂原链霉菌DSM40587； 2)对菌株进行化学诱变比如亚硝基胍(NTG)诱变育种、或者物理诱变比如紫外线 (UV)诱变育种、或者化学法与物理法相结合的诱变育种，筛选出转谷氨酰胺酶表达水平明 显提高的突变菌株。 上述步骤1)中使用的平板培养基(高氏一号)组成如下：20g/L可溶性淀粉，1g/L KNO3，0.5g/L NaCl，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L K2HPO4·3H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，琼脂 粉2％。 通过数百次的诱变实验，终于筛选出转谷氨酰胺酶产量提高了4倍多的两个突变 菌株，分别命名为DSHO0618和NTG-1，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为 CCTCC NO:M 2020148(即DSHO0618)和CCTCC NO:M 2020147(即NTG-1)。 根据本发明的第二个方面，提供了上述转谷氨酰胺酶生产菌CCTCC NO:M2020147 和CCTCC NO:M 2020148在转谷氨酰胺酶的生产中的应用。 在一种实施方式中，通过上述转谷氨酰胺酶生产菌的发酵来生产转谷氨酰胺酶。 其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于茂原链霉菌生长发酵的培养基。 根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L 鱼粉蛋白胨，2g/L MgSO4·7H2O,2g/L K2HPO4·3H2O，NaOH调pH至7.4。 在一种优选的实施方式中，当用于工业化发酵生产时，上述转谷氨酰胺酶生产菌 进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段。这两个阶段分别使用种子培养基和发酵培 养基，发酵培养基可以与种子培养基相同，也可以不相同，例如可以都是上述培养基组成。 优选地，上述发酵温度为30±3℃比如30±2℃或30±1℃。 本发明所构建的转谷氨酰胺酶生产菌通过发酵能够实现发酵液中转谷氨酰胺酶 的有效积累，比原始菌株DSM40587的产酶量提高了至少4倍，完全可以投入工业化应用。 本发明诱变筛选出的转谷氨酰胺酶生产菌的拉丁学名是Streptomyces mobaraensis，中文名称是茂原链霉菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是 2020年5月26日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保 藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO:M 2020147和CCTCC NO:M2020148。 附图说明 图1为转谷氨酰胺酶的作用原理示意图。 图2为转谷氨酰胺酶的酶活测定反应原理图。 图3为诱变菌株DSHO0618和NTG-1的平板培养状态照片。其中左图为DSHO0618，右 图为NTG-1，分别培养了72h。
本发明通过诱变得到了一种转谷氨酰胺酶生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020147或者CCTCC NO:M 2020148。本发明的转谷氨酰胺酶生产菌比原始菌株的转谷氨酰胺酶产酶量提高了4倍多，酶活达到7.5U/mL以上，能够工业化应用。
背景技术：
转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13，Transglutaminase，TGase)又称谷氨酰胺酶转氨酶 (Glutamine transaminase)，简称TG酶，是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性 中心的单体蛋白质，在自然界中广泛存在于人体、高级动物、鱼类、植物和微生物中，例如大 量存在于哺乳动物的各种组织器官(如肝脏、毛囊、表皮、前列腺、血液)。它是一种酰基转移 酶，可通过催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羟酰胺基之间的结合反应(参见 图1)，使蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联。作为一种通过转谷氨酰胺作用形 成共价化合物的聚合酶，借助于两个蛋白质(包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋 白和家禽类肌动球蛋白等)之间的交联反应，提高蛋白质的水溶性、起泡性、可搅拌性、热稳 定性、乳化性等的功能特性。TG酶被称为“21世纪的超级粘合剂”，在食品、医药、纺织、化妆 品等领域应用前景广阔。 在食品领域，该酶能通过引入赖氨酸而提高蛋白质的营养效价，而被其处理过的 食品具有良好的外观和质构，可延长货架期，减少食品中的过敏源。此外，该酶可分解谷氨 酰胺生成谷氨酸和氨，而谷氨酸在食品美味上起着重要作用，因此通过添加该酶可增强食 品的风味。 传统肉类加工工艺通常加入大量的盐和磷酸，以提高其持水力、连贯性和质地。近 些年来，少盐少磷酸的食物被广泛推广，但其质地和物理性质都不尽如人意。TG酶可以替代 部分通常肉制品加工中添加的品质改良剂--磷酸盐，生产低盐肉制品。可应用于水产加工 品、火腿、香肠、面类、豆腐等等。TG酶在40～45℃、pH6-7的条件下，只需添加0.1-0.3％的 量，即可达到明显的效果。 转谷氨酰胺酶主要通过微生物发酵法进行生产，所用的微生物是茂原链霉菌 (Streptomyces mobaraense或Streptomyces mobaraensis)，是我国《食品安全国家标准食 品添加剂使用标准》(GB2760)中唯一合法生产转谷氨酰胺酶的安全菌株。 但目前使用的茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶生产能力偏低，导致发酵液中的酶含量 偏低，因此亟需提高菌株的产酶能力。
技术实现要素：
为了现有转谷氨酰胺酶生产菌株发酵水平低的缺陷，本发明结合化学诱变、物理 诱变和杂交育种来筛选茂原链霉菌突变菌株，获得了高产转谷氨酰胺转氨酶的生产菌株。 因此，本发明的第一个目的在于提供一种转谷氨酰胺酶生产菌。 本发明的第二个目的在于提供上述转谷氨酰胺酶生产菌用于生产转谷氨酰胺酶 的应用。 为了达到上述目的，本发明对于上海东之汇生物科技有限公司所保藏的茂原链霉 3 CN 111593011 A 说 明 书 2/6 页 菌DSM40587设计了如下诱变筛选方案： 1)活化原始菌株茂原链霉菌DSM40587； 2)对菌株进行化学诱变比如亚硝基胍(NTG)诱变育种、或者物理诱变比如紫外线 (UV)诱变育种、或者化学法与物理法相结合的诱变育种，筛选出转谷氨酰胺酶表达水平明 显提高的突变菌株。 上述步骤1)中使用的平板培养基(高氏一号)组成如下：20g/L可溶性淀粉，1g/L KNO3，0.5g/L NaCl，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L K2HPO4·3H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，琼脂 粉2％。 通过数百次的诱变实验，终于筛选出转谷氨酰胺酶产量提高了4倍多的两个突变 菌株，分别命名为DSHO0618和NTG-1，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为 CCTCC NO:M 2020148(即DSHO0618)和CCTCC NO:M 2020147(即NTG-1)。 根据本发明的第二个方面，提供了上述转谷氨酰胺酶生产菌CCTCC NO:M2020147 和CCTCC NO:M 2020148在转谷氨酰胺酶的生产中的应用。 在一种实施方式中，通过上述转谷氨酰胺酶生产菌的发酵来生产转谷氨酰胺酶。 其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于茂原链霉菌生长发酵的培养基。 根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L 鱼粉蛋白胨，2g/L MgSO4·7H2O,2g/L K2HPO4·3H2O，NaOH调pH至7.4。 在一种优选的实施方式中，当用于工业化发酵生产时，上述转谷氨酰胺酶生产菌 进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段。这两个阶段分别使用种子培养基和发酵培 养基，发酵培养基可以与种子培养基相同，也可以不相同，例如可以都是上述培养基组成。 优选地，上述发酵温度为30±3℃比如30±2℃或30±1℃。 本发明所构建的转谷氨酰胺酶生产菌通过发酵能够实现发酵液中转谷氨酰胺酶 的有效积累，比原始菌株DSM40587的产酶量提高了至少4倍，完全可以投入工业化应用。 本发明诱变筛选出的转谷氨酰胺酶生产菌的拉丁学名是Streptomyces mobaraensis，中文名称是茂原链霉菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是 2020年5月26日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保 藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO:M 2020147和CCTCC NO:M2020148。 附图说明 图1为转谷氨酰胺酶的作用原理示意图。 图2为转谷氨酰胺酶的酶活测定反应原理图。 图3为诱变菌株DSHO0618和NTG-1的平板培养状态照片。其中左图为DSHO0618，右 图为NTG-1，分别培养了72h。
