技术摘要：
本发明提供了一种人NPAS2基因的g.[105054insGCCTA]突变形式，突变所在片段序列如SEQ ID NO：2所示；NPAS2基因发生g.[105054insGCCTA]突变的肝癌患者对FOLFOX4化疗方案耐药。可以采用含有5’‑TCACAAAGCCTTTGTGACGT‑3’和5’‑ACACGGTGGTTTTGTCCATT‑3’引物以及5’‑V  全部
背景技术：
肝癌是中国人最常罹患和最易致死的主要癌症，根据国家癌症中心发布的全国最 新癌症报告（2019年版），肝癌发病率位列恶性肿瘤第四位，死亡率则高居恶性肿瘤第二位， 目前国内新发肝癌病例和死亡病例均占世界的一半以上。肝癌早期症状不明显，60%以上的 患者确诊时已是中晚期了，往往失去了手术治疗的最佳机会。化疗是中晚期肝癌的重要治 疗方式，然而肝癌患者对化疗药物的敏感性存在差异，对化疗耐药的肝癌患者的预后非常 差；此外，肝癌癌灶存在异质性且在化疗过程中容易发生新的耐药突变，因此化疗过程中常 常会出现继发性耐药，需要及时变更治疗方案。目前临床上还无法及时准确地预测和评估 肝癌患者对化疗药物的反应，导致大多数肝癌化疗患者不断进行试验性化疗，既耽误病情 又承受了不必要的药物毒副反应。因此，如何在化疗前有效探知原发性耐药以及在化疗过 程中及时监测是否发生继发性耐药十分重要。目前临床上对于肝癌化疗疗效评估主要依靠 的是影像学手段和血清学指标，然而影像学手段往往存在一定的滞后，血清标记物（如血清 甲胎蛋白即AFP）则普遍特异性不强，且这两者均无法有效准确地反映癌灶的分子本质，从 而难以分析和预测其变化趋势，对治疗的指导价值比较有限。为此，亟需寻找特异准确的肝 癌化疗分子标志物，预测和评估化疗疗效，及时发现耐药人群和耐药时间节点，以便有效指 导化疗方案的选择和及时变更。 目前临床上在癌症治疗中使用的结合了氟尿嘧啶、奥沙利铂等常用化疗药物优点 的FOLFOX4化疗方案，由于其在整体反应率、疾病控制率、无进展生存期、总生存期方面，均 优于传统化疗药物（如阿霉素），且耐受性和安全性较好，因此自2011年起FOLFOX4方案就被 原国家卫生部颁发的《原发性肝癌诊疗规范》所收录，推荐用于治疗晚期原发性肝癌。本发 明针对接受FOLFOX4方案化疗治疗的原发性肝癌（下文简称肝癌）患者，采集其化疗前和化 疗过程中的血样并提取其细胞外游离DNA（cell-free  DNA，即cfDNA），通过二代DNA测序技 术解析其中的循环肿瘤DNA（circulating  tumor  DNA即ctDNA）来监测癌灶突变变动信息， 并结合临床疗效评估信息分析，结果发现NPAS2（Neuronal  PAS  domain  protein  2）基因的 两种特定突变以及CNOT1（CCR4-NOT  transcription  complex  subunit  1）基因的两种特定 突变可以做为肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药的标志物，而缺乏有效特异的化疗疗效和耐药 评估分子标志物正是FOLFOX4方案在肝癌化疗上面临的一大棘手难题，导致其难以实现精 准化疗。 NPAS2基因的编码蛋白最早被发现存在于脑细胞中，实际上它在几乎所有周围组 织中均有表达分布。NPAS2基因是机体维持正常生物节律所必需的基因，其编码表达的 NPAS2蛋白参与了人体生物钟的调控，并在细胞生长、分化凋亡、肿瘤生长抑制等诸多方面 3 CN 111593125 A 说　明　书 2/9 页 发挥重要作用。当其突变或缺失后，会引起节律系统的紊乱。研究发现当NPAS2基因异常表 达时，与昼夜节律性相关的疾病如高血压、代谢综合征、肿瘤、心脑血管疾病等发病率可能 增加。然而目前尚不清楚该基因在癌症发生发展过程中发挥了什么作用以及是如何发挥作 用的。本发明首次发现了NPAS2基因的两种特定突变，并将其应用于肝癌行FOLFOX4方案化 疗耐药的预测和评估中，这对于肝癌患者化疗方案尤其是FOLFOX4方案的选择和及时变更 意义显著，可以有效提高原发性肝癌患者行FOLFOX4方案化疗的受益，避免无效化疗和没必 要的化疗毒副作用；同时对于原发性肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药机制的研究和有效化疗 药物的研发具有重要的价值。
技术实现要素：
本发明提供了NPAS2基因的两种特定突变及其检测试剂盒和方法，这两种特定基 因突变可以做为原发性肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药的分子标志物应用于耐药的预测和分 析中。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下： 本发明的目的（1）在于提供一种发生g.[105009_105012delGCTT]突变的人NPAS2突变 基因，它是由野生型NPAS2基因的第105009-105012位点缺失GCTT这4个核苷酸而形成的，而 NCBI登录号为NG_023259.1所示序列中的第4989-181679范围内的序列即为NPAS2野生型基 因的参考序列，则g.[105009_105012delGCTT]突变所在片段的序列如SEQ  ID  NO：1所示，其 余序列参见NPAS2野生型基因参考序列；NPAS2基因发生g.[105009_105012delGCTT]突变的 肝癌患者对FOLFOX4化疗方案耐药。发生g.[105009_105012delGCTT]突变的NPAS2基因可以 应用于肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药检测试剂盒、检测方法和治疗药物的研发。 本发明的目的（2）在于提供一种发生g.[105054insGCCTA]突变的人NPAS2突变基 因，它是由野生型NPAS2基因的第105054位点插入GCCTA这5个核苷酸而形成的，而NCBI登录 号为NG_023259.1所示序列中的第4989-181679范围内的序列即为NPAS2野生型基因的参考 序列，则g.[105054insGCCTA]突变所在片段的序列如SEQ  ID  NO：2所示，其余序列参见 NPAS2野生型基因参考序列；NPAS2基因发生g .[105054insGCCTA]突变的肝癌患者对 FOLFOX4化疗方案耐药。发生g.[105054insGCCTA]突变的NPAS2基因可以应用于肝癌行 FOLFOX4方案化疗耐药检测试剂盒、检测方法和治疗药物的研发。 本发明的目的（3）在于提供用于检测NPAS2基因g.[105009_105012delGCTT]突变 的检测引物和探针，其中NPAS2基因g.[105009_105012delGCTT]突变所在片段的序列如SEQ  I D  N O：1所示，其余序列参见NPAS2野生型基因参考序列；所述检测引物为5’- TCACAAAGCCTTTGTGACGT-3’和5’-ACACGGTGGTTTTGTCCATT-3’，检测探针为5’-FAM- CAGACTCGAAACAAG-MGB-NFQ-3’；检测引物和探针可用于构建NPAS2基因g .[105009_ 105012delGCTT]变检测试剂盒和检测方法，特别是用于构建基于数字PCR或实时荧光定量 PCR的NPAS2基因g.[105009_105012delGCTT]突变检测方法。 本发明的目的（4）在于提供用于检测NPAS2基因g.[105054insGCCTA]突变的检测 引物和探针，其中NPAS2基因g.[105054insGCCTA]突变所在片段的序列如SEQ  ID  NO：2所 示，其余序列参见NPAS2野生型基因参考序列；所述检测引物为5’-TCACAAAGCCTTTGTGACGT- 3’和5’-ACACGGTGGTTTTGTCCATT-3’，检测探针为5’-VIC-AATGCCTAGTTCTCA-MGB-NFQ-3’；检 4 CN 111593125 A 说　明　书 3/9 页 测引物和探针可用于构建NPAS2基因g.[105054insGCCTA]突变检测试剂盒和检测方法，特 别是用于构建基于数字PCR或实时荧光定量PCR的NPAS2基因g.[105054insGCCTA]突变检测 方法。 本发明提供的NPAS2基因的g.[105009_105012delGCTT]和g.[105054insGCCTA]这 两种突变形式目前尚未见报道，这两种突变可以做为肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药的基因 标志物，从而可以应用于耐药的预测和评估中，具有准确特异和及时有效的优点；此外还提 供了针对突变的特异性检测引物和探针。这对于肝癌患者化疗方案尤其是FOLFOX4方案的 选用和及时变更意义显著，可以有效提高肝癌行FOLFOX4方案化疗的受益，避免无效化疗和 没必要的化疗毒副作用；同时对于肝癌行FOLFOX4方案化疗耐药机制的研究和有效化疗药 物的研发具有重要的价值。 附图说明 图1是人NPAS2基因第3号外显子特定突变示意图。图中间白色方框代表第3号外显 子，两边黑色方框代表内含子；左右箭头指向处分别为g.[105009_105012delGCTT]突变和 g.[105054insGCCTA]突变发生处。