技术摘要：
本发明公开了一种协同提高并稳定蛹虫草多种活性物质的生产方法，属于食药两用真菌子实体生产技术领域。步骤为：（1）将大米、小麦、黄豆粉碎混匀，加入营养液，制备生长培养基；（2）以在同一根菌丝上同时具有迭瓦状的拟青霉型和聚集为头状的轮枝孢型产孢结构的蛹虫草 全部
背景技术：
蛹虫草是一种名贵食疗两用菌中药材，具有广泛的医药保健价值。研究表明，蛹虫 草含有蛋白质、氨基酸、宏量元素、微量元素、多种维生素等多种人体必需的营养成分，且高 于其它真菌食品，此外它还富含独特的腺苷、虫草素、喷司他丁、虫草酸、虫草多糖、SOD酶、 有机硒等活性物质。这些活性物质集蛹虫草于一身，构成一个天然大配方，以整体配合的效 果来调整人体的生理机能，能使血液、体液、神经、激素等多方面的人体机能发展正常化，从 总体上提高人体免疫力，因此蛹虫草被认为是中西医结合，预防和治疗疾病的最佳天然食 品。现代医学研究表明，蛹虫草具有益肺补肾、止血化痰、护肝抗癌等多种功能，特别能提高 免疫功能,是治未病的优良食品。 随着近代人工栽培技术的发展，对蛹虫草活性物质的研究集中于单项活性物质研 究，但对蛹虫草多种活性物质协同稳定提高缺乏研究。中国专利CN201010186974.5公开了 蛹虫草多种缺失对喷司他丁这一具有抗癌的重要活性物质的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种协同提高并稳定蛹虫草多种活性物质的生产方法。 本发明是通过以下技术方案实现的： 一种协同提高并稳定蛹虫草多种活性物质的生产方法，步骤为： （1）制备生长培养基：将大米、小麦、黄豆粉碎混匀，加入营养液，封口灭菌，即得； （2）制备蛹虫草异宗配合协调的有效复合液体种： 以在同一根菌丝上同时具有迭瓦状的拟青霉型和聚集为头状的轮枝孢型产孢结构的 蛹虫草母种为有效母种，以链霉菌母种为伴生菌，同时将有效母种和伴生菌接种于液体培 养基，摇瓶培养，得到有效复合液体种； （3）接种与培养： 将有效复合液体种稀释后接种于生长培养基，协调培养40-60天； （4）采收加工： 收取子实体，闭光摊凉，用浸泡有干松针的60度白洒喷洒子实体表面，在500LX灯光下 堆放三天，60℃烘干至含水分≤12%，即得。 进一步地，所述的蛹虫草母种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏号：CGMCC NO 5577，保藏时间：2011.12.12。 所述的蛹虫草母种为专利号ZL201210248399.6记载的抗退化蛹虫草菌种。 所述的链霉菌母种为CPCC200004抗肿瘤链霉菌，购于中国医学科学院药生所。 所述的液体培养基：土豆200g、玉米粉30g、白砂糖20g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾 3 CN 111587735 A 说 明 书 2/6 页 1.5g、亚硫酸钠0.02g、吲哚乙酸0.01g、水1000ml，将上述物料煮溶，取滤液，补足水1000ml， 分装于500ml三角瓶中，装量为120ml/瓶，封口，120℃灭菌30分钟，冷却至30℃以下时接种。 所述的接种液体培养基，静置72-96小时，控温25-28℃，当液面散满菌丝后进入摇 瓶培养，23-25℃，120-240r/分钟，72-120小时，液体中充满菌丝球，液体清彻，即为有效复 合液体种。 所述的协调培养包括发菌培养、搔菌培养，转色摧芽培养：促草生长培养，其中所 述发菌培养为18-21℃，湿度为70-75%，避光培养10-15天，所述搔菌培养为用硬毛刷沾上 PH9的石灰水，将菌皮刷破，形成PH值内外差（培养基内PH值＜6），所述的转色摧芽培养温度 16-24℃，湿度为80-90%，24小时光照，时间7-10天；所述促草生长培养温度18-22℃,28-35 天。 所述的促草生长培养阶段，当子实体长到3-5cm时，用磁化水喷洒培养基和子实 体。 第一、关于菌种的选择，由于蛹虫草是典型的异宗配合，即在一个菌株中同时含有 拟青霉Paeilomyces和轮枝孢霉Vertcillium两种基因，否则不能结实，此外两种基因比例 不协调，其结实的子实体及活性物质含量上也会有差异，这是从制种上协同栽培蛹虫草多 种活性物质的一个基本原则，具体选种时需镜检母种，对蛹虫草母种，无论是自己分离的或 是引进的，显微镜下观察在同一根菌丝上，同时具有迭瓦状的拟青霉型和聚集为头状的轮 枝孢型产孢结构，而且必须是两种构型数量基本平衡，即为有效母种，两种构型只有其一则 为无效种需废之，本发明优选蛹虫草母种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏号：CGMCC NO 5577，保藏时间：2011.12.12，也可用专利号：ZL201210248399.6 为抗退化蛹虫草菌种；有效复合液体种需以链霉菌伴生，所用链霉菌购于中国医学科学院 药生所，编号为CPCC200004抗肿瘤链霉菌。 第二、制备营养均衡的液体培养基：土豆200g、玉米粉30g、白砂糖20g、蛋白胨3g、 磷酸二氢钾1.5g、亚硫酸钠0.02g、吲哚乙酸0.01g、水1000ml，将上述物料煮溶，取滤液，补 足水1000ml，分装于500ml三角瓶中，装量为120ml/瓶，封口，120℃灭菌30分钟，冷却至30℃ 以下时接种，无菌操作接种，每瓶接入蛹虫草有效母种2-3mm2大小的菌块2-3块，再接入链 霉菌2mm2一块，菌块要浮于液面，不得下沉，闭光，两种菌共发酵；静置72-96小时，控温25- 28℃，当液面散满菌丝后进入摇瓶培养，摇瓶培养：23-25℃，120-240r/分钟，72-120小时， 液体中充满菌丝球，液体清彻，即为有效复合液体种。 第三、关于生长培养基的制备，根据蛹虫草的生物学特征，在富含有机营养素的培 养基上长时间生长，可均衡积累活性物质，而适当添加无机营养成分，能起到诱导和刺激作 用，从而使各项活性物质协同增加，本发明生长培养基以大米：小麦：黄豆的重量比为4:4:2 粉碎成粗粉进行混合，营养液是以蚕蛹粉40g，白砂糖20g、VC0.1g、VB10.2g、亚硫酸钠0.1g、 水1000ml混合而得，将生长培养基分装，装量为溶积的1/40至1/16，然后加入营养液，加入 量为固体培养基的1.2倍-1.4倍，用聚丙烯封口后，120℃灭菌1小时，冷却至30℃无菌操作 接种即可。 第四、将有效复合液种加入三倍于原种的无菌水稀释混匀，在无菌条件下，用接种 枪接入生长培养基中，接入量为生长培养基料的30-35%，封口后进入协调培养，一般需要 40-60天，具体按照以下步骤操作：第一步为发菌培养，要求闭光，18-21℃的温度，70-75%的 4 CN 111587735 A 说 明 书 3/6 页 湿度，每日早晚通风各一次，每次不少于1小时，至表面形成完整一层菌皮为好，时间10-15 天，第二步为搔菌培养，用硬毛刷沾上PH9的石灰水，将菌皮刷破，形成PH值内外差（培养基 内PH值＜6），有利于子实体芽的均衡形成，第三步为转色摧芽培养，温度14-25℃，形成昼夜 温差不少于8℃，湿度为80-90%，24小时光照200-500LX，早晚通风各一次，每次不少于1小 时，时间7-10天，培养基全部转为深黄色，表面均匀长出子实体芽，第四步为促草生长培养， 共需要28-35天，其中光照500-3500LX，每日不少于12小时，且按下列七个段照射500-800- 1000-1500-2500-3000-3500LX，用LED低温光照进行，早晚各通风1次，每次不少于1小时，同 时用开有小孔的塑料膜包覆，以增强容器内外氧气的交换，此外可以播放音乐，以达到刺激 虫草多种活性物质的均衡积累的目的，在子实体长到3-5cm时，用磁化水喷洒培养基和子实 体，当子实体长高到即将要散发孢子而未散发时，去掉用于封口的塑料膜，用40W紫外灯，垂 直于子实体30-40cm之距照射40-60秒，封口，闭光，培养3-5天，保持18-22℃，每天通风4小 时，子实体有衰退现象时及时采收。 第五、采收时用消毒夹收取子实体，室内闭光摊凉，吹干表水，用20g 干松针与 1000ml60度白洒浸泡液喷洒子实体表面，轻轻搓柔，在500LX 灯光下堆放三天，每12小时翻 堆一次，促进各项活性物质稳定，在60℃烘干至含水分≤12%，装袋密封保藏。 为了验证本发明的效果，对蛹虫草子实体的活性物质腺苷、虫草素、喷司他丁、多 糖、虫草酸、SOD酶、有机硒等七种成分的含量分别进行检测，结果如表1所示，从表1可以看 出，依据本发明方法生产的蛹虫草的多种活性物质协同高含量并稳定，高于常规产品和天 然品含量的3-30倍之多，其中常规产品和天然产品取于东北和秦巴的市售产品。 腺苷(%) 虫草素(%) 喷司他丁(%) 多糖(%) 虫草酸(%) 硒（µg/g） SOD(µ/mg) 本发明产品 0.55 0.37 0.37 50.41 28.22 0.96 1986 常规栽培产品 0.1-0.2 0.03-0.05 0 5-6.11 5-25.11 0.038 54 天然产品 0.11-0.48 0.31 0.003 2.5 4-8 0.038 691 检测方法 高效液相色谱法 高效液相色谱法 高效液相色谱法 硫酸苯酚法 高碘酸钠比色法 原子吸收光谱法 超声波破壁法 表1 综上所述，本发明可促使多种活性成分的含量协同提高并稳定生产，尤其是抗癌物质 喷司他丁、多糖、虫草酸和SOD酶的含量提高明显，可产业化推广应用。
本发明公开了一种协同提高并稳定蛹虫草多种活性物质的生产方法，属于食药两用真菌子实体生产技术领域。步骤为：（1）将大米、小麦、黄豆粉碎混匀，加入营养液，制备生长培养基；（2）以在同一根菌丝上同时具有迭瓦状的拟青霉型和聚集为头状的轮枝孢型产孢结构的蛹虫草 全部
背景技术：
蛹虫草是一种名贵食疗两用菌中药材，具有广泛的医药保健价值。研究表明，蛹虫 草含有蛋白质、氨基酸、宏量元素、微量元素、多种维生素等多种人体必需的营养成分，且高 于其它真菌食品，此外它还富含独特的腺苷、虫草素、喷司他丁、虫草酸、虫草多糖、SOD酶、 有机硒等活性物质。这些活性物质集蛹虫草于一身，构成一个天然大配方，以整体配合的效 果来调整人体的生理机能，能使血液、体液、神经、激素等多方面的人体机能发展正常化，从 总体上提高人体免疫力，因此蛹虫草被认为是中西医结合，预防和治疗疾病的最佳天然食 品。现代医学研究表明，蛹虫草具有益肺补肾、止血化痰、护肝抗癌等多种功能，特别能提高 免疫功能,是治未病的优良食品。 随着近代人工栽培技术的发展，对蛹虫草活性物质的研究集中于单项活性物质研 究，但对蛹虫草多种活性物质协同稳定提高缺乏研究。中国专利CN201010186974.5公开了 蛹虫草多种缺失对喷司他丁这一具有抗癌的重要活性物质的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种协同提高并稳定蛹虫草多种活性物质的生产方法。 本发明是通过以下技术方案实现的： 一种协同提高并稳定蛹虫草多种活性物质的生产方法，步骤为： （1）制备生长培养基：将大米、小麦、黄豆粉碎混匀，加入营养液，封口灭菌，即得； （2）制备蛹虫草异宗配合协调的有效复合液体种： 以在同一根菌丝上同时具有迭瓦状的拟青霉型和聚集为头状的轮枝孢型产孢结构的 蛹虫草母种为有效母种，以链霉菌母种为伴生菌，同时将有效母种和伴生菌接种于液体培 养基，摇瓶培养，得到有效复合液体种； （3）接种与培养： 将有效复合液体种稀释后接种于生长培养基，协调培养40-60天； （4）采收加工： 收取子实体，闭光摊凉，用浸泡有干松针的60度白洒喷洒子实体表面，在500LX灯光下 堆放三天，60℃烘干至含水分≤12%，即得。 进一步地，所述的蛹虫草母种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏号：CGMCC NO 5577，保藏时间：2011.12.12。 所述的蛹虫草母种为专利号ZL201210248399.6记载的抗退化蛹虫草菌种。 所述的链霉菌母种为CPCC200004抗肿瘤链霉菌，购于中国医学科学院药生所。 所述的液体培养基：土豆200g、玉米粉30g、白砂糖20g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾 3 CN 111587735 A 说 明 书 2/6 页 1.5g、亚硫酸钠0.02g、吲哚乙酸0.01g、水1000ml，将上述物料煮溶，取滤液，补足水1000ml， 分装于500ml三角瓶中，装量为120ml/瓶，封口，120℃灭菌30分钟，冷却至30℃以下时接种。 所述的接种液体培养基，静置72-96小时，控温25-28℃，当液面散满菌丝后进入摇 瓶培养，23-25℃，120-240r/分钟，72-120小时，液体中充满菌丝球，液体清彻，即为有效复 合液体种。 所述的协调培养包括发菌培养、搔菌培养，转色摧芽培养：促草生长培养，其中所 述发菌培养为18-21℃，湿度为70-75%，避光培养10-15天，所述搔菌培养为用硬毛刷沾上 PH9的石灰水，将菌皮刷破，形成PH值内外差（培养基内PH值＜6），所述的转色摧芽培养温度 16-24℃，湿度为80-90%，24小时光照，时间7-10天；所述促草生长培养温度18-22℃,28-35 天。 所述的促草生长培养阶段，当子实体长到3-5cm时，用磁化水喷洒培养基和子实 体。 第一、关于菌种的选择，由于蛹虫草是典型的异宗配合，即在一个菌株中同时含有 拟青霉Paeilomyces和轮枝孢霉Vertcillium两种基因，否则不能结实，此外两种基因比例 不协调，其结实的子实体及活性物质含量上也会有差异，这是从制种上协同栽培蛹虫草多 种活性物质的一个基本原则，具体选种时需镜检母种，对蛹虫草母种，无论是自己分离的或 是引进的，显微镜下观察在同一根菌丝上，同时具有迭瓦状的拟青霉型和聚集为头状的轮 枝孢型产孢结构，而且必须是两种构型数量基本平衡，即为有效母种，两种构型只有其一则 为无效种需废之，本发明优选蛹虫草母种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏号：CGMCC NO 5577，保藏时间：2011.12.12，也可用专利号：ZL201210248399.6 为抗退化蛹虫草菌种；有效复合液体种需以链霉菌伴生，所用链霉菌购于中国医学科学院 药生所，编号为CPCC200004抗肿瘤链霉菌。 第二、制备营养均衡的液体培养基：土豆200g、玉米粉30g、白砂糖20g、蛋白胨3g、 磷酸二氢钾1.5g、亚硫酸钠0.02g、吲哚乙酸0.01g、水1000ml，将上述物料煮溶，取滤液，补 足水1000ml，分装于500ml三角瓶中，装量为120ml/瓶，封口，120℃灭菌30分钟，冷却至30℃ 以下时接种，无菌操作接种，每瓶接入蛹虫草有效母种2-3mm2大小的菌块2-3块，再接入链 霉菌2mm2一块，菌块要浮于液面，不得下沉，闭光，两种菌共发酵；静置72-96小时，控温25- 28℃，当液面散满菌丝后进入摇瓶培养，摇瓶培养：23-25℃，120-240r/分钟，72-120小时， 液体中充满菌丝球，液体清彻，即为有效复合液体种。 第三、关于生长培养基的制备，根据蛹虫草的生物学特征，在富含有机营养素的培 养基上长时间生长，可均衡积累活性物质，而适当添加无机营养成分，能起到诱导和刺激作 用，从而使各项活性物质协同增加，本发明生长培养基以大米：小麦：黄豆的重量比为4:4:2 粉碎成粗粉进行混合，营养液是以蚕蛹粉40g，白砂糖20g、VC0.1g、VB10.2g、亚硫酸钠0.1g、 水1000ml混合而得，将生长培养基分装，装量为溶积的1/40至1/16，然后加入营养液，加入 量为固体培养基的1.2倍-1.4倍，用聚丙烯封口后，120℃灭菌1小时，冷却至30℃无菌操作 接种即可。 第四、将有效复合液种加入三倍于原种的无菌水稀释混匀，在无菌条件下，用接种 枪接入生长培养基中，接入量为生长培养基料的30-35%，封口后进入协调培养，一般需要 40-60天，具体按照以下步骤操作：第一步为发菌培养，要求闭光，18-21℃的温度，70-75%的 4 CN 111587735 A 说 明 书 3/6 页 湿度，每日早晚通风各一次，每次不少于1小时，至表面形成完整一层菌皮为好，时间10-15 天，第二步为搔菌培养，用硬毛刷沾上PH9的石灰水，将菌皮刷破，形成PH值内外差（培养基 内PH值＜6），有利于子实体芽的均衡形成，第三步为转色摧芽培养，温度14-25℃，形成昼夜 温差不少于8℃，湿度为80-90%，24小时光照200-500LX，早晚通风各一次，每次不少于1小 时，时间7-10天，培养基全部转为深黄色，表面均匀长出子实体芽，第四步为促草生长培养， 共需要28-35天，其中光照500-3500LX，每日不少于12小时，且按下列七个段照射500-800- 1000-1500-2500-3000-3500LX，用LED低温光照进行，早晚各通风1次，每次不少于1小时，同 时用开有小孔的塑料膜包覆，以增强容器内外氧气的交换，此外可以播放音乐，以达到刺激 虫草多种活性物质的均衡积累的目的，在子实体长到3-5cm时，用磁化水喷洒培养基和子实 体，当子实体长高到即将要散发孢子而未散发时，去掉用于封口的塑料膜，用40W紫外灯，垂 直于子实体30-40cm之距照射40-60秒，封口，闭光，培养3-5天，保持18-22℃，每天通风4小 时，子实体有衰退现象时及时采收。 第五、采收时用消毒夹收取子实体，室内闭光摊凉，吹干表水，用20g 干松针与 1000ml60度白洒浸泡液喷洒子实体表面，轻轻搓柔，在500LX 灯光下堆放三天，每12小时翻 堆一次，促进各项活性物质稳定，在60℃烘干至含水分≤12%，装袋密封保藏。 为了验证本发明的效果，对蛹虫草子实体的活性物质腺苷、虫草素、喷司他丁、多 糖、虫草酸、SOD酶、有机硒等七种成分的含量分别进行检测，结果如表1所示，从表1可以看 出，依据本发明方法生产的蛹虫草的多种活性物质协同高含量并稳定，高于常规产品和天 然品含量的3-30倍之多，其中常规产品和天然产品取于东北和秦巴的市售产品。 腺苷(%) 虫草素(%) 喷司他丁(%) 多糖(%) 虫草酸(%) 硒（µg/g） SOD(µ/mg) 本发明产品 0.55 0.37 0.37 50.41 28.22 0.96 1986 常规栽培产品 0.1-0.2 0.03-0.05 0 5-6.11 5-25.11 0.038 54 天然产品 0.11-0.48 0.31 0.003 2.5 4-8 0.038 691 检测方法 高效液相色谱法 高效液相色谱法 高效液相色谱法 硫酸苯酚法 高碘酸钠比色法 原子吸收光谱法 超声波破壁法 表1 综上所述，本发明可促使多种活性成分的含量协同提高并稳定生产，尤其是抗癌物质 喷司他丁、多糖、虫草酸和SOD酶的含量提高明显，可产业化推广应用。
