技术摘要：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种pH敏感纳米载体及其在基因药物递送系统中的应用。本发明提供一种pH敏感纳米载体，所述的pH敏感纳米载体为PEG‑PHis‑PSD三嵌段共聚物修饰在阳离子脂质体的表面，即所述的pH敏感纳米载体由阳离子脂质体与聚乙二醇‑聚组氨酸‑聚磺 全部
背景技术：
恶性肿瘤已经成为导致世界范围人类死亡的首要疾病之一，成为严重威胁人类生 存质量的世界性难题。基因治疗(gene therapy)具有高度安全性、高效性以及特异性等优 势应用越来越广泛。但是siRNA的递送主要有以下几个障碍：首先，在生理环境下siRNA极不 稳定，易被血清中的核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)迅速降解。另外，siRNA是一个带负 电的亲水大分子，而细胞膜表面的负电荷导致其细胞膜穿透能力极差。之后，siRNA进入靶 细胞后需从溶酶体逃逸至胞浆中，避免进入溶酶体被吞噬降解，随后才能介导RNAi。因此， 开发具有多功能递药系统来有效递送siRNA势在必行。 用于递送siRNA的多功能基因递送载体主要有脂质体、阳离子胶束和蛋白多肽类 等，由于阳离子脂质体具有低毒，易修饰、良好的生物相容性、基因负载率高等特性被广泛 应用。但是其稳定性差、转染效率低、肿瘤靶向性较差等缺点也一直限制阳离子脂质体的应 用。因此通过对脂质体表面修饰具有一定功能的共聚物来提高基因递送系统的稳定性、转 染效率和肿瘤靶向性。 大量文献报道肿瘤部位的生理环境与正常组织存在显著差别。其中包括弱酸性、 高浓度还原物质谷胱甘肽(GSH)以及高水平活性氧(ROS)等。当纳米载体以内吞的形式进入 内涵体或溶酶体时，pH值会进一步降低(pH 5.0-6.0)。因此根据肿瘤细胞低pH的特性，可以 设计各种基于pH敏感的聚合物药物传输载体。 在众多pH敏感材料中，聚组氨酸(poly(histidine) ,PHis)由于具有高生物相容 性、低毒性，尤其是溶酶体逃逸功能脱颖而出。组氨酸的咪唑环在生理环境下(pH 7.4)为疏 水性，而当pH低于pKa时，由于其质子化变为亲水，实现“质子海绵效应”达到溶酶体逃逸作 用，增加药物的胞内释放。 聚磺胺二甲氧嘧啶(poly(sulfadimethoxine) ,PSD)具有磺胺类化合物的普遍特 性，显示弱酸性。在高pH环境中，由于磺酰基团(-SO2NH-)中的氧原子具有较高的电负性，能 够吸引硫原子的电子，从而吸引氮原子的电子，导致N-H键的电子云移向氮原子从而释放出 质子。SD中的二甲氧嘧啶基团也是吸电子基团，这也促使氮原子更易释放出质子。所以当在 正常生理pH条件下，PSD表面带有负电荷，当在溶酶体酸性环境下，PSD表面电荷会从负电荷 转变为中性电荷，实现电荷反转。 4 CN 111607093 A 说 明 书 2/6 页
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新型的pH敏感纳米载体，以提高基因药物递送的稳定 性，提高特异性以及快速释放基因药物的作用。 本发明通过以下技术方案实现上述目的： 本发明提供了PSD-PHis-PEG三嵌段共聚物，其结构式如下： 其中：n＝40～50。 本发明所述的PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物，通过如下方法制备： (1)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的合成：采用自由基引发溶剂聚合法，合成pH敏感聚 合物聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)。 (2)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)经NHS和DCC催化后与聚组氨酸(PHis)进行酰胺化反 应得到产物聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD-PHis)。 (3)一端羧基化的聚乙二醇(PEG)经过酰胺化反应与PSD-PHis进行连接，得终产物 聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)。 PSD的合成：磺胺二甲氧嘧啶(SD)和NaOH溶于丙酮/水，缓慢滴加过量的甲基丙稀 酰氯(MC)，甲醇/水纯化3-4h，过滤，真空干燥48h，即得SD酰化产物(SDM)。SDM溶于二甲基甲 酰胺(DMF)中，通入氮气，加入AIBN密封，迅速滴加巯基乙胺搅拌，70-80℃持续通氮气48h， 水中陈化3-4h，过滤，真空干燥48h，即得PSD。 PHis-PSD的合成：Fmoc-NH-PHis-COOH、NHS和EDC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，氮气 保护下室温搅拌24h，加入PSD的DMSO溶液，氮气保护下室温搅拌48h，冰乙醚沉淀，过滤，真 空干燥得Fmoc-NH-PHis-PSD；除Fmoc保护：Fmoc-NH-PHis-PSD溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加 入二乙胺反应2-3h，旋蒸，加入冰乙醚沉淀产物，过滤，真空干燥即得PHis-PSD粉末。 PEG-PHis-PSD的合成：PEG、NHS和EDC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，氮气保护下室温 搅拌24h，加入PHis-PSD的DMSO溶液，氮气保护室温搅拌48h，透析袋(MW 3500)透析48-72h， 冻干即得PEG-PHis-PSD粉末。 本发明提供一种pH敏感纳米载体，所述的pH敏感纳米载体为PEG-PHis-PSD三嵌段 共聚物修饰在阳离子脂质体的表面，即所述的pH敏感纳米载体由阳离子脂质体与聚乙二 醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物正负电荷吸附连接，在生理 环境中(pH7.3～7.4)，阳离子脂质体与聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis- PSD)三嵌段共聚物正负电荷吸附，即得一种新型的pH敏感纳米载体。 所述的阳离子脂质体中至少含有(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)。 进一步地，所述的阳离子脂质体组成为：DOTAP与如下物质中的一种或几种的组 5 CN 111607093 A 说 明 书 3/6 页 合：大豆卵磷脂、胆固醇、蛋黄卵磷脂等。 优选为DOTAP、大豆卵磷脂、胆固醇的组合。 其中，DOTAP:大豆卵磷脂：胆固醇＝4～8:2～4:1。 所述的阳离子脂质体通过如下方法制备：DOTAP、大豆磷脂、胆固醇溶于氯仿和甲 醇的混合溶剂，所述的氯仿和甲醇的混合溶剂中，氯仿：甲醇的体积比为3-4:1，减压旋转蒸 发除去有机溶剂，形成干燥的脂质薄膜；加入水作为水相水化，超声处理后，0.22μm聚碳酸 酯膜进行整粒，即得阳离子脂质体(L)。 进一步地，本发明提供了药物与pH敏感纳米载体通过静电作用结合获得的脂质纳 米载体，所述的纳米脂质载体通过如下步骤制备：在生理环境中(pH7.3～7.4)，药物与带正 电荷的阳离子脂质通过静电作用结合形成LR。之后，负电荷的PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物 与LR正负电荷吸附，即得一种新型的含药pH敏感脂质纳米载体(PHD/LR)。 所述的药物为基因药物，核酸类药物，选自：siRNA、miRNA、质粒DNA，所述核酸类药 物带有负电荷，与带有正电荷的pH敏感纳米载体正负电荷吸附作用结合形成含药pH敏感脂 质纳米载体。 基因药物与pH敏感纳米载体的重量比为：1～10：1。 脂质体的结构与正常的生物膜具有较高的相似度，这就决定了脂质体容易被体循 环中的各种物质降解代谢从而减少其在体内的循环时间。为解决这一问题，本发明中聚乙 二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物达到长循环作用；制备的 脂质体粒径较小(约150nm-200nm)，其可以通过EPR效应特异性富集于肿瘤组织从而体现靶 向性；基因药物递送到肿瘤细胞内，被溶酶体吞噬，由于其表面的PHis的“质子海绵效应”达 到溶酶体逃逸效果，将基因药物释放到细胞质中；同时，由于溶酶体偏酸性环境下，pH敏感 性的PSD从负电荷变为中性电荷，从阳离子脂质体表面脱离，快速释放出基因药物，从而发 挥治疗作用。 与现有技术相比，本发明具有以下优点： 1)本发明的含药pH敏感脂质纳米载体中，pH敏感纳米载体中的阳离子脂质与基因 药物通过静电作用结合，提高了基因药物在pH敏感纳米载体中的包封率，制备方法简单易 行，重现性好，稳定性高； 2)本发明中，制备的脂质体粒径较小(约150-200nm)，其可以通过EPR效应特异性 富集于肿瘤组织从而具有靶向性； 3)本发明中，pH敏感三嵌段共聚物的PEG可以增加其在血液中循环时间，PHis快速 的溶酶体逃逸功能，同时由于pH敏感的PSD链的存在，其可以快速的在肿瘤部位释放基因药 物。 4)本发明中，与空白阳离子脂质体相比，通过静电吸附将PSD-PHis-PEG修饰在阳 离子脂质体表面，增加制剂的稳定性，提高特异性以及增强靶向性。 附图说明 图1为本发明所述实例1的共聚物的1HNMR图谱： (A)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的1HNMR图谱；(B)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD- PHis)的1HNMR图谱；(C)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸-聚乙二醇(PSD-PHis-PEG)的1HNMR图 6 CN 111607093 A 说 明 书 4/6 页 谱； 图2为本发明所述实例1的共聚物的FTIR图谱： (A)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的FTIR图谱；(B)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD- PHis)的FTIR图谱；(C)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸-聚乙二醇(PSD-PHis-PEG)的FTIR图 谱； 图3为本发明所述实例3的pH敏感PHD/LR的pH敏感性考察图。 图4为本发明所述实例4的pH敏感PHD/LR的透射电子显微镜图片。 图5为本发明所述实例4的pH敏感PHD/LR的原子力显微镜图片。 图6为本发明所述实例5的PHD/LR在不同pH模拟介质中的体外释放实验。 图7为本发明所述实例6的PHD/LR的体外肝素解络实验图片。 图8为本发明所述实例7的PHD/LR的体外血清稳定性实验图片。 图9为本发明所述实施例8的PHD/LR的体内抗肿瘤实验肿瘤体积变化图。 图10为本发明所述实施例8的PHD/LR的体内抗肿瘤实验小鼠体重变化图。
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种pH敏感纳米载体及其在基因药物递送系统中的应用。本发明提供一种pH敏感纳米载体，所述的pH敏感纳米载体为PEG‑PHis‑PSD三嵌段共聚物修饰在阳离子脂质体的表面，即所述的pH敏感纳米载体由阳离子脂质体与聚乙二醇‑聚组氨酸‑聚磺 全部
背景技术：
恶性肿瘤已经成为导致世界范围人类死亡的首要疾病之一，成为严重威胁人类生 存质量的世界性难题。基因治疗(gene therapy)具有高度安全性、高效性以及特异性等优 势应用越来越广泛。但是siRNA的递送主要有以下几个障碍：首先，在生理环境下siRNA极不 稳定，易被血清中的核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)迅速降解。另外，siRNA是一个带负 电的亲水大分子，而细胞膜表面的负电荷导致其细胞膜穿透能力极差。之后，siRNA进入靶 细胞后需从溶酶体逃逸至胞浆中，避免进入溶酶体被吞噬降解，随后才能介导RNAi。因此， 开发具有多功能递药系统来有效递送siRNA势在必行。 用于递送siRNA的多功能基因递送载体主要有脂质体、阳离子胶束和蛋白多肽类 等，由于阳离子脂质体具有低毒，易修饰、良好的生物相容性、基因负载率高等特性被广泛 应用。但是其稳定性差、转染效率低、肿瘤靶向性较差等缺点也一直限制阳离子脂质体的应 用。因此通过对脂质体表面修饰具有一定功能的共聚物来提高基因递送系统的稳定性、转 染效率和肿瘤靶向性。 大量文献报道肿瘤部位的生理环境与正常组织存在显著差别。其中包括弱酸性、 高浓度还原物质谷胱甘肽(GSH)以及高水平活性氧(ROS)等。当纳米载体以内吞的形式进入 内涵体或溶酶体时，pH值会进一步降低(pH 5.0-6.0)。因此根据肿瘤细胞低pH的特性，可以 设计各种基于pH敏感的聚合物药物传输载体。 在众多pH敏感材料中，聚组氨酸(poly(histidine) ,PHis)由于具有高生物相容 性、低毒性，尤其是溶酶体逃逸功能脱颖而出。组氨酸的咪唑环在生理环境下(pH 7.4)为疏 水性，而当pH低于pKa时，由于其质子化变为亲水，实现“质子海绵效应”达到溶酶体逃逸作 用，增加药物的胞内释放。 聚磺胺二甲氧嘧啶(poly(sulfadimethoxine) ,PSD)具有磺胺类化合物的普遍特 性，显示弱酸性。在高pH环境中，由于磺酰基团(-SO2NH-)中的氧原子具有较高的电负性，能 够吸引硫原子的电子，从而吸引氮原子的电子，导致N-H键的电子云移向氮原子从而释放出 质子。SD中的二甲氧嘧啶基团也是吸电子基团，这也促使氮原子更易释放出质子。所以当在 正常生理pH条件下，PSD表面带有负电荷，当在溶酶体酸性环境下，PSD表面电荷会从负电荷 转变为中性电荷，实现电荷反转。 4 CN 111607093 A 说 明 书 2/6 页
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新型的pH敏感纳米载体，以提高基因药物递送的稳定 性，提高特异性以及快速释放基因药物的作用。 本发明通过以下技术方案实现上述目的： 本发明提供了PSD-PHis-PEG三嵌段共聚物，其结构式如下： 其中：n＝40～50。 本发明所述的PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物，通过如下方法制备： (1)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的合成：采用自由基引发溶剂聚合法，合成pH敏感聚 合物聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)。 (2)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)经NHS和DCC催化后与聚组氨酸(PHis)进行酰胺化反 应得到产物聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD-PHis)。 (3)一端羧基化的聚乙二醇(PEG)经过酰胺化反应与PSD-PHis进行连接，得终产物 聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)。 PSD的合成：磺胺二甲氧嘧啶(SD)和NaOH溶于丙酮/水，缓慢滴加过量的甲基丙稀 酰氯(MC)，甲醇/水纯化3-4h，过滤，真空干燥48h，即得SD酰化产物(SDM)。SDM溶于二甲基甲 酰胺(DMF)中，通入氮气，加入AIBN密封，迅速滴加巯基乙胺搅拌，70-80℃持续通氮气48h， 水中陈化3-4h，过滤，真空干燥48h，即得PSD。 PHis-PSD的合成：Fmoc-NH-PHis-COOH、NHS和EDC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，氮气 保护下室温搅拌24h，加入PSD的DMSO溶液，氮气保护下室温搅拌48h，冰乙醚沉淀，过滤，真 空干燥得Fmoc-NH-PHis-PSD；除Fmoc保护：Fmoc-NH-PHis-PSD溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加 入二乙胺反应2-3h，旋蒸，加入冰乙醚沉淀产物，过滤，真空干燥即得PHis-PSD粉末。 PEG-PHis-PSD的合成：PEG、NHS和EDC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，氮气保护下室温 搅拌24h，加入PHis-PSD的DMSO溶液，氮气保护室温搅拌48h，透析袋(MW 3500)透析48-72h， 冻干即得PEG-PHis-PSD粉末。 本发明提供一种pH敏感纳米载体，所述的pH敏感纳米载体为PEG-PHis-PSD三嵌段 共聚物修饰在阳离子脂质体的表面，即所述的pH敏感纳米载体由阳离子脂质体与聚乙二 醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物正负电荷吸附连接，在生理 环境中(pH7.3～7.4)，阳离子脂质体与聚乙二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis- PSD)三嵌段共聚物正负电荷吸附，即得一种新型的pH敏感纳米载体。 所述的阳离子脂质体中至少含有(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)。 进一步地，所述的阳离子脂质体组成为：DOTAP与如下物质中的一种或几种的组 5 CN 111607093 A 说 明 书 3/6 页 合：大豆卵磷脂、胆固醇、蛋黄卵磷脂等。 优选为DOTAP、大豆卵磷脂、胆固醇的组合。 其中，DOTAP:大豆卵磷脂：胆固醇＝4～8:2～4:1。 所述的阳离子脂质体通过如下方法制备：DOTAP、大豆磷脂、胆固醇溶于氯仿和甲 醇的混合溶剂，所述的氯仿和甲醇的混合溶剂中，氯仿：甲醇的体积比为3-4:1，减压旋转蒸 发除去有机溶剂，形成干燥的脂质薄膜；加入水作为水相水化，超声处理后，0.22μm聚碳酸 酯膜进行整粒，即得阳离子脂质体(L)。 进一步地，本发明提供了药物与pH敏感纳米载体通过静电作用结合获得的脂质纳 米载体，所述的纳米脂质载体通过如下步骤制备：在生理环境中(pH7.3～7.4)，药物与带正 电荷的阳离子脂质通过静电作用结合形成LR。之后，负电荷的PEG-PHis-PSD三嵌段共聚物 与LR正负电荷吸附，即得一种新型的含药pH敏感脂质纳米载体(PHD/LR)。 所述的药物为基因药物，核酸类药物，选自：siRNA、miRNA、质粒DNA，所述核酸类药 物带有负电荷，与带有正电荷的pH敏感纳米载体正负电荷吸附作用结合形成含药pH敏感脂 质纳米载体。 基因药物与pH敏感纳米载体的重量比为：1～10：1。 脂质体的结构与正常的生物膜具有较高的相似度，这就决定了脂质体容易被体循 环中的各种物质降解代谢从而减少其在体内的循环时间。为解决这一问题，本发明中聚乙 二醇-聚组氨酸-聚磺胺二甲氧嘧啶(PEG-PHis-PSD)三嵌段共聚物达到长循环作用；制备的 脂质体粒径较小(约150nm-200nm)，其可以通过EPR效应特异性富集于肿瘤组织从而体现靶 向性；基因药物递送到肿瘤细胞内，被溶酶体吞噬，由于其表面的PHis的“质子海绵效应”达 到溶酶体逃逸效果，将基因药物释放到细胞质中；同时，由于溶酶体偏酸性环境下，pH敏感 性的PSD从负电荷变为中性电荷，从阳离子脂质体表面脱离，快速释放出基因药物，从而发 挥治疗作用。 与现有技术相比，本发明具有以下优点： 1)本发明的含药pH敏感脂质纳米载体中，pH敏感纳米载体中的阳离子脂质与基因 药物通过静电作用结合，提高了基因药物在pH敏感纳米载体中的包封率，制备方法简单易 行，重现性好，稳定性高； 2)本发明中，制备的脂质体粒径较小(约150-200nm)，其可以通过EPR效应特异性 富集于肿瘤组织从而具有靶向性； 3)本发明中，pH敏感三嵌段共聚物的PEG可以增加其在血液中循环时间，PHis快速 的溶酶体逃逸功能，同时由于pH敏感的PSD链的存在，其可以快速的在肿瘤部位释放基因药 物。 4)本发明中，与空白阳离子脂质体相比，通过静电吸附将PSD-PHis-PEG修饰在阳 离子脂质体表面，增加制剂的稳定性，提高特异性以及增强靶向性。 附图说明 图1为本发明所述实例1的共聚物的1HNMR图谱： (A)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的1HNMR图谱；(B)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD- PHis)的1HNMR图谱；(C)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸-聚乙二醇(PSD-PHis-PEG)的1HNMR图 6 CN 111607093 A 说 明 书 4/6 页 谱； 图2为本发明所述实例1的共聚物的FTIR图谱： (A)聚磺胺二甲氧嘧啶(PSD)的FTIR图谱；(B)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸(PSD- PHis)的FTIR图谱；(C)聚磺胺二甲氧嘧啶-聚组氨酸-聚乙二醇(PSD-PHis-PEG)的FTIR图 谱； 图3为本发明所述实例3的pH敏感PHD/LR的pH敏感性考察图。 图4为本发明所述实例4的pH敏感PHD/LR的透射电子显微镜图片。 图5为本发明所述实例4的pH敏感PHD/LR的原子力显微镜图片。 图6为本发明所述实例5的PHD/LR在不同pH模拟介质中的体外释放实验。 图7为本发明所述实例6的PHD/LR的体外肝素解络实验图片。 图8为本发明所述实例7的PHD/LR的体外血清稳定性实验图片。 图9为本发明所述实施例8的PHD/LR的体内抗肿瘤实验肿瘤体积变化图。 图10为本发明所述实施例8的PHD/LR的体内抗肿瘤实验小鼠体重变化图。
