技术摘要：
本发明提供一种靶向响应性释放系统，所述靶向响应性释放系统包含嵌合凋亡小体，所述嵌合凋亡小体包含凋亡小体膜和包裹于所述凋亡小体膜中的介孔纳米粒子，所述凋亡小体膜为来源于免疫细胞的凋亡小体膜，所述介孔纳米粒子负载有活性物质。为构建具有靶向运载功能和精确  全部
背景技术：
细胞外囊泡（Extracellular  vesicles  ，EVs）是细胞间通讯中传递信号转导分子 的载体，可携带核酸、蛋白质、脂类等多种功能分子发挥作用。同时，天然膜赋予细胞外囊泡 免疫原性低、同源靶向性强、循环时间长、生物屏障可达等诸多优点，是人工材料无法比拟 的。受这些卓越性能的启发，细胞外囊泡被视为新一代的交付系统。制备具有多种生物活性 分子或靶向配体修饰的工程化细胞外囊泡，在理想位点产生治疗效果，成为疾病治疗的一 种有吸引力的策略。 凋亡小体(Apoptotic  bodies，ABs)是由凋亡细胞分泌的一种细胞外囊泡，由细胞 膜向外起泡产生。有确凿的证据表明，吞噬凋亡细胞可以调节免疫应答的抗炎方向。类似的 结果也只反映在凋亡细胞/囊泡膜的吞噬，这可能与表面的磷脂酰丝氨酸密切相关。 工程化细胞外囊泡的制备采用了多种治疗性分子加载方法，主要包括电穿孔法、 预络合法、胞外囊泡分离前亲代细胞转染法、皂素渗透法和超声法。然而，现有的方法在以 下方面仍有相当大的局限性，比如，无法去除与治疗目的无关的残留成分，可能导致潜在的 威胁；现有方法中在表面生化偶联各种功能分子可能会破坏细胞外囊泡的靶向性结构和功 能；缺乏智能性的胞内控制开关，保证工程化细胞外囊泡运载的功能性治疗分子准确有效 的释放。 溃疡性结肠炎是一种病因和发病机制尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性病因， 发病率在我国逐年上升，其发病机制并不明确。其病变部位主要局限于结肠黏膜和黏膜下 层，发病时结肠黏膜充血、水肿，呈弥漫性炎症反应，现有的治疗手段很难将溃疡性结肠炎 完全根除。溃疡性结肠炎反复发作和难以治愈一方面影响了患者的生活质量，另一方面还 增加了癌变的可能，严重威胁到患者的生命健康。针对溃疡性结肠炎的治疗也缺乏特异性 方法，成为近些年消化领域的热点。目前可用的治疗方法是减少炎症、减轻症状，并在最好 的情况下导致长期缓解。然而，长期使用这些药物会带来多种副作用，如感染、肾脏或肝脏 损害。 同时，传统和现有的治疗皮肤损伤和溃疡性结肠炎的药物不仅对其他组织器官有 副作用而且治疗效果欠佳，需要一种有特定治疗功能的药物来代替以达到更好的效果且减 轻或消除药物本身带来的副作用。因此，需要合适的具有天然生物功能和靶向性的原始细 胞外囊泡以及新颖的制造策略来解决这些问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种靶向响应性释放系统及 其制备方法和应用，为构建具有靶向运载功能和精确药物释放功能的特异性治疗产品提供 3 CN 111588704 A 说　明　书 2/9 页 有效的手段。 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一方面，提供一种靶向响应性释放系统，所述靶向响应性释放系统包含嵌合凋亡小体， 所述嵌合凋亡小体包含凋亡小体膜和包裹于所述凋亡小体膜中的介孔纳米粒子，所述凋亡 小体膜为来源于免疫细胞的凋亡小体膜，所述介孔纳米粒子负载有活性物质。 优选地，所述免疫细胞选自淋巴细胞，所述淋巴细胞选自T细胞、B淋巴细胞或NK淋 巴细胞。 优选地，所述介孔纳米粒子选自介孔二氧化硅纳米粒子。可以针对不同负载的活 性物质选择不同的介孔纳米粒子。 优选地，所述活性物质通过静电作用或物理吸附作用负载在所述介孔纳米粒子 上。 优选地，所述活性物质选自核酸、蛋白质、脂类或小分子化合物。 优选地，所述活性物质通过靶细胞内多肽或酶的作用可响应性释放于靶细胞内。 优选地，所述活性物质选自MicroRNA-21、姜黄素中的一种或二者的结合。 优选地，所述活性物质选自MicroRNA-21。MicroRNA-21是免疫调节的非编码微小 RNA之一，MicroRNA-21通过调节巨噬细胞表型在炎症消退中起着重要作用，因此，选择 MicroRNA-21作为模型药物，通过该靶向响应性释放系统构建的模块化系统实现了 MicroRNA-21的有效传递。 优选地，所述MicroRNA-21上标记有Cy5，以便于通过检测荧光强度来进行跟踪检 测。 优选地，所述MicroRNA-21通过靶细胞胞浆中的谷胱甘肽破坏二硫键导致 MicroRNA-21释放于靶细胞内。 优选地，所述MicroRNA-21可以由任何类似功能或类似特点的药物或者小分子代 替，应用于不同疾病的治疗中。 优选地，所述活性物质选自姜黄素。利用本发明优选实施例提供的靶向响应性释 放系统可以将疏水性的姜黄素输送到炎症细胞，避免了脱靶效应，提高了姜黄素的利用率 和有效性。 优选地，所述姜黄素通过物理吸附作用负载在介孔二氧化硅纳米粒子的孔隙中 后，所述介孔二氧化硅纳米粒子用聚二甲基丙烯酸甘油酯包封。可防止介孔二氧化硅纳米 粒子在药物运载过程中造成姜黄素泄漏。 优选地，所述姜黄素通过靶细胞内的酯酶降解所述聚二甲基丙烯酸甘油酯，从而 响应性释放于靶细胞内。 优选地，所述姜黄素可以由任何类似功能或类似特点的药物或者小分子代替，应 用于不同疾病的治疗中。 另一方面，提供上述的靶向响应性释放系统的制备方法，包括以下步骤：将负载有 活性物质的介孔二氧化硅纳米粒子与凋亡小体膜混合，获得混合液，将所述混合液在超声 仪中间歇性地超声2min，然后在5000g条件下离心10min，取沉淀重悬于水中4℃储存，即得 所述靶向响应性释放系统。 再一方面，提供上述的靶向响应性释放系统在制备炎症疾病靶向治疗药物中的应 4 CN 111588704 A 说　明　书 3/9 页 用。 优选地，所述炎症疾病包括皮肤炎症、结肠炎、肺炎、肝炎、肾炎或风湿性关节炎。 术语解释： 凋亡小体膜：是指将凋亡小体中的内容物去除掉以后，获得的一种囊泡膜。 介孔纳米粒子：是指具有较大比表面积和吸附容量的纳米级微型颗粒。 相对于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明所述功能性嵌合凋亡小体利用T 细胞的潜在炎症靶向作用和来源于T细胞的凋亡小体膜的炎症调节特性，将来源于T细胞的 凋亡小体膜与介孔纳米粒子传递系统融合，构建了可以靶向传递活性物质，尤其是 MicroRNA-21和姜黄素的功能性嵌合凋亡小体，所述功能性嵌合凋亡小体去除了凋亡小体 中的包内成分，同时保持了凋亡小体膜的靶向性和炎症调节特性，能够在靶细胞中准确释 放活性物质，例如，MicroRNA-21和姜黄素，避免了负载活性物质的功能性嵌合凋亡小体发 生脱靶效应或者活性物质泄露，同时构建的功能性嵌合凋亡小体继承了天然凋亡小体膜的 优势，能够主动靶向到炎症部位，解决了传统药物对炎症疾病治疗效果欠佳，对其他组织器 官副作用大的问题；并解决了使用普通的凋亡小体膜构建的功能性嵌合凋亡小体在受体细 胞内启动下游的信号传导后，受体细胞内的内溶酶体系统对内化的功能性嵌合凋亡小体的 内吞和处置会极大地降低功能性嵌合凋亡小体所装载活性物质的利用效率的问题，极大的 提高了活性物质在受体细胞内的传递效率和利用率。 此外，为制造具有模块化设计和特定治疗功能的标准化工程细胞外囊泡提供了有 效的策略。在不改变本发明构思的情况下，根据本发明设计的介孔纳米粒子负载活性物质 并在靶细胞内响应性的释放的基本原理，可以针对不同活性物质设计不同的负载方法和靶 向响应性缓释系统。 使用本发明提供的功能性嵌合凋亡小体的制备方法制备得到的功能性嵌合凋亡 小体去除了凋亡小体中的包内成分，同时保持了凋亡小体膜的靶向性和炎症调节特性，能 够在靶细胞中准确释放活性物质，避免了负载活性物质的功能性嵌合凋亡小体发生脱靶效 应或者活性物质泄露，同时构建的功能性嵌合凋亡小体继承了天然凋亡小体膜的优势，能 够主动靶向到炎症部位。 附图说明 图1显示了嵌合凋亡小体在透射电子显微镜下的核-壳结构； 图2A  为嵌合凋亡小体和介孔二氧化硅纳米粒子分别在水中和PBS中的稳定性检测结 果统计图； 图2B显示了嵌合凋亡小体冻干前和冻干重悬后的稳定性检测结果； 图2C显示了嵌合凋亡小体和介孔二氧化硅纳米粒子在血清中的稳定性检测结果； 图3A显示了实施例7中PBS组（对照组）的巨噬细胞标志物F4/80染色图； 图3B显示了实施例7中PBS组（对照组）的PKH26/RhB染色图； 图3C显示了实施例7中PBS组（对照组）的Hoechst染色图； 图3D显示了实施例7中PBS组（对照组）的Merge图； 图3E显示了实施例7中凋亡小体膜组的巨噬细胞标志物F4/80染色图； 图3F显示了实施例7中凋亡小体膜组的PKH26标记的凋亡小体膜染色图； 5 CN 111588704 A 说　明　书 4/9 页 图3G显示了实施例7中凋亡小体膜组的Hoechst染色图； 图3H显示了实施例7中凋亡小体膜组的Merge图； 图3I显示了实施例7中介孔二氧化硅纳米粒子组的巨噬细胞标志物F4/80染色图； 图3J显示了实施例7中介孔二氧化硅纳米粒子组的RhB标记的介孔二氧化硅纳米粒子 染色图； 图3K显示了实施例7中介孔二氧化硅纳米粒子组的Hoechst染色图； 图3L显示了实施例7中介孔二氧化硅纳米粒子组的Merge图； 图3M显示了实施例7中嵌合凋亡小体组的巨噬细胞标志物F4/80的染色图； 图3N显示了实施例7中嵌合凋亡小体组的RhB标记的嵌合凋亡小体的染色图； 图3O显示了实施例7中嵌合凋亡小体组的Hoechst染色图； 图3P显示了实施例7中嵌合凋亡小体组的Merge图； 图4A为实施例8中TNF-α的检测结果； 图4B为实施例8中IL-6的检测结果； 图4C为实施例8中TGF-β的检测结果； 图4D为实施例8中IL-10的检测结果； 图5为实施例9中谷胱甘肽触发释放MicroRNA-21的检测结果； 图6为实施例10中酯酶降解聚二甲基丙烯酸甘油酯以启动姜黄素的释放曲线； 图7为实施例12中皮肤炎症损伤模型损伤部位的生物分布检测结果； 图8为皮肤炎症损伤模型伤口愈合检测结果； 图9A-9E分别为正常皮肤组、PBS组、cABs组、cABsMicroRNA-21组和cABsCur组皮肤损伤部位 的HE染色结果； 图10为实施例15中不同给药组溃疡性结肠炎模型损伤部位的生物分布； 图11A为实施例16不同给药组小鼠体重的监测结果； 图11B为实施例16中不同给药组结肠长度检测结果； 图12A-12E  分别为正常组、PBS组、cABs组、cABsMicroRNA-21组和cABsCur结肠组织的HE染 色结果。 具体实施例 下面通过