技术摘要：
本发明公开了一种用于检测凝块收缩力的柔性微柱环阵列及其制备方法和应用。微柱环阵列由若干个呈周期性排列的微柱行组成，每个所述微柱行上具有若干个微柱环，每个所述微柱环由四个或四个以上围成环状的微柱组成；所述微柱环内具有一定直径的圆形孔隙，检测凝块收缩力  全部
背景技术：
凝血是一项非常重要的生理过程，该过程必须受到人体的合理调控，以保持出血 与血栓形成之间的微妙平衡。凝血功能不足会导致病人在发生创伤时失血过多，而过高的 凝血功能往往伴随着产生血栓的风险。凝血功能检验在临床上有着重要的角色。在心肺流 转过程中，手术医师需要即时检测血液的凝血功能，以指导促凝剂和抗凝剂的服用，防止血 液在体外循环中凝固[1]。此外，手术引起的失血、接触性凝血激活、血液稀释等，造成血液 中血小板和凝血因子的损失，从而不可避免地造成部分病人在手术后引发凝血功能障碍 [2]。因此，围手术期的凝血功能障碍的医治应该在临床凝血检验的指导下进行，以提高治 疗方案的针对性，减小对血液制品的需求。而且，除了围手术期的护理之外，凝血检验在许 多其他的临床场景下也有很重要的应用，比如对脓毒症[6]、产科出血[7]、血栓性疾病等的 治疗[8]。可靠的凝血功能检验技术可以为此类疾病的治疗提供宝贵的信息，指导医生的临 床决策，从而提高治疗的效率，降低治疗成本。 传统的凝血检验方法包括凝血酶原时间(prothrombin  time,PT)、活化部分凝血 活酶时间(activated  partial  thromboplastin  time ,aPTT)、凝血酶时间(thrombin  time ,TT)、纤维蛋白原浓度(fibrinogen ,FIB)等[9]。这些检验虽然在临床上已被广泛应 用，但是它们存在着一定的不足。例如，PT、aPTT、TT仅在时间尺度上检验凝血响应速度，而 对凝块的机械性能缺乏关注。另一方面，血栓的形成与血管、血小板、凝(抗凝)血因子、血液 粘稠度等因素都有重要的联系，特别是血小板功能的变化，而这四个检验普遍使用血浆作 为检验标本，因此细胞成分(如血小板)对凝血功能的影响无法被检测到[10]。此外，这些检 验在纤维蛋白聚合后就结束检验，所以凝块的稳定性和纤溶过程也无法被检测到[3]。需要 更新判断凝血功能检验的方法。 近年来，全血标本的粘弹性检测系统在临床上获得了一些认可[11]。在血液的凝 固过程中，纤维蛋白原交联导致血液的粘度增加并逐渐成为凝胶状固体。该类检验方法是 通过实时监测全血在凝血过程中的粘弹性变化得到血栓弹力图，进而推算出反应时间和凝 块的最大粘弹性等，更加全面地检验了凝血功能，弥补了传统检验方法的不足。较为成功的 商业化仪器包括TEG(Haemonetics公司)、ROTEM(Instrumentation  Laboratory公司)、 Sonoclot  Analyzer(Sienco公司)等。据文献报道，由TEG和ROTEM得到的凝血功能检验结果 在一定程度上减少了心脏手术过程中和手术后病人的输血需求[12]，Sonoclot在一些血栓 性疾病的诊断中也有显著的效果[13]。鉴于血栓粘弹性检测在凝血检验上的潜力，许多小 型化血液粘弹性检验装置也相继被报道，以用于即时凝血功能检验(point-of-care  testing ,POCT)[14-20]。血栓粘弹性检测虽然是对血小板功能动态变化的描述，但对血小 4 CN 111551701 A 说　明　书 2/11 页 板功能的监测并不具备特异性，而且成本费用极其昂贵，目前多用于术中作为快速检查，判 断血液凝血系统的变化，以决定输血治疗的方案。 而且，血液的粘弹性检验并未能全面地反应凝块的机械性能。有研究证实，凝块的 收缩是凝血功能的另一个重要指标，因此测量凝块收缩力有望成为一种测量凝血功能的重 要方法。如图1所示，图1是凝块收缩力产生示意图，大致分为四步。首先内皮细胞损伤，胶原 蛋白和范威氏因子(von  Willebrand  Factor,vWF)暴露于血液中；血液中的血小板和胶原 蛋白及vWF接触后释放颗粒，血小板被激活并相互聚集；引发凝血级联反应产生凝血酶，在 凝血酶的作用下纤维蛋白原转化为纤维蛋白，纤维蛋白网罗白细胞和红细胞，形成凝块。与 此同时，血小板产生凝块收缩力(clot  retraction  force,CRF)，使凝块收缩变硬。因此，凝 块收缩力的大小及其动态变化可作为凝血功能的检验指标。 有研究者将荧光珠子和单个血小板附着在柔性基底上。血小板收缩带动柔性基底 变形使荧光珠子的位置发生改变，用荧光显微镜实时监测荧光珠子的位置变化，用于推算 单个血小板收缩力[21](图2a)。此外，有人在原子力显微镜的悬臂梁和聚丙烯酰胺水凝胶 基底上修饰纤维蛋白原和胶原蛋白，使血小板附着在基底和悬臂梁之间；血小板收缩使悬 臂梁变形，悬臂梁的形变用于计算单个血小板收缩力[22](图2b)，但此方法血小板的捕获 效率低。有人在此基础上开发了具有更高通量的血小板检测装置[23](图2c)，还是使用聚 丙烯酰胺水凝胶作为基底，并在上面修饰排列规则的纤维蛋白原微点阵列，用于捕获血小 板；血小板收缩使纤维蛋白微点阵列位置发生变化并用其推算血小板收缩力。图2d中血小 板被涂在附有胶原蛋白的微柱块上，并往通道内输入全血，制造流体环境。当血小板收缩 时，微柱块弯曲产生位移，该位移用于计算血小板收缩力，并在全血流体环境下，研究流体 剪切力对血小板收缩力的影响[24]。图2e用微柱对顶部的胶原蛋白微组织捕获流动的血小 板，形成团聚物，血小板收缩使微柱对弯曲产生位移用于计算流体剪切力下血小板收缩力， 并利用底层可伸缩膜测量血小板团聚物凝固前后的刚度变化[25]。 但上述方法装置加工复杂，需要极精密的检验平台和复杂的数据采集设备，比如 荧光显微镜、原子力显微镜；检验成本高，使得其只适合于做机理性研究，临床转化难度大。 此外，上述方法需要从血液中分离血小板，操作复杂化。 其中，参考文献为： [1] .Sarkar ,M .；Prabhu ,V .,Basics  of  cardiopulmonary  bypass .Indian  journal  of  anaesthesia  2017,61(9) ,760. 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技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种小型化、低成本、操作便捷用于检测凝块收缩力的柔 性微柱环阵列及其制备方法和应用。 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 一种用于检测凝块收缩力的柔性微柱环阵列，所述微柱环阵列由若干个呈周期性 排列的微柱行组成，每个所述微柱行上具有若干个微柱环，每个所述微柱环由四个或四个 以上围成环状的微柱组成；所述微柱环内具有一定直径的圆形孔隙，检测凝块收缩力时，将 全血滴入该微柱环的圆形孔隙内进行凝血检验。 本发明利用固液气体系的界面张力以及微柱的阻力使全血样本高效固定在微柱 环内，阻止全血液体外流；同时利用微柱作为力传感器，实时测量凝块收缩力的大小；微柱 环中的每一个微柱都是一个力传感器，检测结果灵敏度高；血液滴入微柱环内，当血液凝固 收缩时，带动微柱环四周的微柱弯曲产生位移，最终微柱产生的位移转化为凝块收缩力。该 柔性微柱环阵列用于检测凝块收缩力的检验成本低，检测灵敏度高，而且容易临床转化；此 外，无需从血液中分离血小板，可用全血进行检测，操作简单的同时还充分考虑了血液中其 7 CN 111551701 A 说　明　书 5/11 页 他成分对血小板收缩的影响，检测结果更加客观全面。 在本发明较佳的实施例中，所述微柱环的直径为1～3mm，每个微柱环的间距为1～ 5mm；所述微柱的柱高为1.2～1.6mm，柱上表面直径0.2～0.4mm。 微柱的直径、柱高以及微柱环的直径、微柱数量都会影响检测结果。根据悬臂梁理 论，微柱的直径和柱高决定了检测灵敏度，在一定范围内，直径越小、柱高越大，检测灵敏度 越高。而微柱环的直径也会影响滴入的血量，而微柱的数量也需要控制在适当范围，全血是 通过表面张力固定在微柱环内的，若微柱数量过少，则会加大血液形变对检测结果的影响； 而微柱数量过多，则会造成微柱之间相互干扰，影响检测结果。在设计微柱环阵列时要协同 考虑上述各因素，充分利用固液界面之间的表面张力固定全血检测样本，减少血液形变对 检测结果的影响。 在本发明较佳的实施例中，所述微柱环阵列为圆形阵列、椭圆形阵列或多边形阵 列中的任一种；所述微柱呈圆柱形、椭圆柱形或多边形柱体中的任一种。 在本发明较佳的实施例中，每个所述微柱环由4～8个围成环状的微柱组成。 在本发明较佳的实施例中，所述全血的体积为3～6μL。 本发明利用固液气体系的界面张力以及微柱的阻力使得血液样本可高效固定在 微柱环内，在保证血液样本能和微柱环四周的微柱充分接触的情况下，可以做到少量样本 检测。而且，滴入全血量的体积会影响检验结果。血量越多，由于重力作用引起的血液形变 对检测结果的影响会加大，因为血液形变会导致微柱产生不规则的弯曲，干扰实验结果。而 血量过少，则可能导致全血检测样本和微柱接触不充分而检测不到凝块收缩力。实验发现， 滴入的全血量体积受微柱环直径的影响，当微柱环的直径为1～3mm时，全血量体积合适的 取值范围在3～6μL。 本发明还提供了一种用于检测凝块收缩力的柔性微柱环阵列芯片，包括底层的柔 性基底，以及所述的柔性微柱环阵列，所述柔性微柱环阵列设置在所述底层柔性基底上。 本发明还提供了一种制备所述用于检测凝块收缩力的柔性微柱环阵列芯片的方 法，包括以下步骤： S1.利用仿真软件模拟微柱受力弯曲的场景，对微柱进行加工设计，确定微柱的可 行性尺寸和实际弹簧系数，以及PDMS材料的相关参数； S2.根据S1的设计结果利用激光切割亚克力板得到模具，最后使用PDMS进行倒模 制成所述用于检测凝块收缩力的柔性微柱环阵列芯片。 本发明利用激光雕刻和柔性材料PDMS倒模的方法加工得到微柱环阵列或微柱环 阵列芯片。本发明的柔性基底和柔性基底上的微柱环阵列可同步加工得到。两者都是通过 柔性材料PDMS倒模得到，PDMS聚合物的生物相容性佳，在生物材料领域运用广泛。 本发明的制备方法简单，数据采集容易，很好的克服了现有技术中多层显微光刻 和软光刻技术加工微柱需要复杂加工方法和设备的缺陷。现有方法需要精密的加工仪器， 而且所加工得到为微柱对、微柱块等结构，所得微柱的尺寸为微米级，弹簧系数小。而本发 明的微柱采用激光雕刻和PDMS倒模的方法得到微柱尺寸为毫米级的微柱环结构，弹簧系数 较大，可满足实际检测的需要，加工工艺简单，不需要复杂的加工设备。另外，与现有文献中 报道中仅用血小板作为检测样本不同，本发明采用全血作为检测样本，充分考虑了血液中 其他成分对血小板收缩的影响，检测结果更加客观全面。 8 CN 111551701 A 说　明　书 6/11 页 在本发明较佳的实施例中，S1所述确定微柱的可行性尺寸的方法为：在30～50μN 范围内改变边界载荷的大小，并调整微柱尺寸的大小，仿真计算出微柱的弯曲位移，确定该 弯曲位移对应下的理论可行性微柱尺寸，用于指导实际微柱尺寸的设计。 在本发明较佳的实施例中，S1所述确定微柱的实际弹簧系数的方法为：给微柱半 侧施加不同大小的边界载荷，仿真计算出微柱的弯曲位移，根据胡克定律对边界载荷及弯 曲位移进行线性拟合，所得斜率即为微柱的实际弹簧系数。 在本发明较佳的实施例中，S2所述利用激光切割亚克力板得到模具的方法为：将 亚克力板一侧的膜撕下，并在该侧贴上双面胶，另一侧则保留亚克力板膜；切割时将有双面 胶的一侧朝向激光头的另一侧，在CAD软件打点模式下切割亚克力板。 在本发明较佳的实施例中，S2所述使用PDMS进行倒模的方法为：将PDMS基质与固 化剂按质量比10～20：1混合搅拌均匀，抽真空脱气得到混合液，然后在55～65℃下加热固 化6～10h使PDMS固化；冷却后切割即得。 在本发明较佳的实施例中，所述PDMS材料的杨氏模量、泊松比、密度分别为200～ 400kPa、0.4～0.5、900～1000kg/m3。 本发明还提供了一种凝血检验系统，包括实验记录组件和控温组件；其中，所述实 验记录组件包括显微镜、摄像机以及计算机，所述显微镜通过摄像机与计算机连接，实时记 录微柱顶端的位移变化；所述控温组件包括控温器、加热带以及控温盒，所述加热带位于控 温盒的四周，所述控温器与加热带连接，检测时将所述柔性微柱环阵列芯片放进控温盒内 即可。 相应地，所述的柔性微柱环阵列、所述的柔性微柱环阵列芯片、或所述的凝血检验 系统在血液检测中的应用，也在本发明的保护范围之内。 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 本发明提供了一种小型化、低成本、操作便捷用于检测凝块收缩力的柔性微柱环 阵列及其制备方法和应用。本发明的柔性微柱环阵列具有操作简单、加工简单以及数据采 集容易等特点，可以做到低成本检测。另外，微柱环的设计巧妙，可以使血液样本凭借微柱、 空气及血液三者固、气、液之间的界面张力的合力高效固定在微柱环内，实验操作简单快 速，且微柱环的小尺寸设计使得样本消耗量非常少，可以做到少量检测。而且，将其设计成 微柱环阵列，可以实现高灵敏度、高通量和多靶标检测。同时，本发明采用全血为样本，充分 考虑了血液其他成分对凝块收缩力的影响，可以更加全面评估血小板产生的凝块收缩力。 附图说明 图1为凝块收缩力产生示意图。 图2为现有技术文献报道的凝块收缩力检测方法；其中，图2(a)为牵引力显微技术 检测单个血小板的收缩力；图2(b)为纤维蛋白原捕获单个血小板用于检测血小板收缩力； 图2(c)为高通量的血小板检测装置；图2(d)为用微柱块研究了流体剪切力对血小板收缩力 的影响；图2(e)为用微柱阵列对作为力传感器，用微柱弯曲的位移计算流体剪切力下的血 小板收缩力，并利用底层可伸缩膜测量血小板团聚物凝固前后的刚度变化。 图3为单个柔性微柱环和柔性微柱环阵列芯片的示意图，其中图3(a)为单个柔性 微柱环，图3(b)为柔性微柱环阵列芯片。 9 CN 111551701 A 说　明　书 7/11 页 图4为本发明柔性微柱环阵列从设计、制造到使用的流程示意图。 图5为微柱弯曲的力学模型；其中图5(a)为数值模拟中微柱的形变与应力分布；图 5(b)为微柱弹簧系数的计算结果。 图6为柔性微柱环阵列和其芯片的加工示意图。 图7为实际应用中的凝血检验系统；其中图7(a)为凝血检验系统，图7(b)为凝血检 验芯片。 图8为凝血检验的图像处理流程。 图9为本发明柔性微柱环阵列和其芯片的有效性验证；其中图9(a)为凝块收缩力 的实验结果图；图9(b)为凝块收缩力曲线。 图10为凝血功能正常与偏弱患者的凝块收缩力的检测结果。 图11为凝血检验系统的结构示意图，其中1-显微镜、2-摄像机、3-计算机、6-控温 器、5-加热带、4-控温盒、7-柔性微柱环阵列芯片。