技术摘要：
本发明公开了一种抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法。本发明通过在枯草芽孢杆菌生长过程中加入大肠杆菌BW25113敲除子ΔatpA、ΔatpB、ΔatpC、ΔatpD、ΔatpH、ΔdcuA、ΔguaA、Δlpd、ΔpurA、ΔsucB、ΔubiE、ΔubiH或ΔygaP，可有效抑制枯草芽孢杆菌生物被膜的形  全部
背景技术：
枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有机物中,是一种革兰氏阳性菌，并且其 生长、繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形 成皱醭，是一种需氧菌。枯草芽孢杆菌菌体自身可以合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素 酶等酶类；能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体(人体)内干扰素和 巨噬细胞的活性。枯草芽孢杆菌已经在水产养殖、植物抗病、动物饲料生产、水质净化和堆 肥发酵等方面都具有和很好的应用，但是，在一些特殊领域，枯草芽孢杆菌依然是一个有害 菌，如在日化产品和工业产品领域，已经有很多的文献报道从日化产品中分离得到了枯草 芽孢杆菌，如陈艺彩等(2010年)从工业腐败变质样品中分离到44株芽孢杆菌属的细菌，占 分离得到细菌总数的29.63％，同时，工业杀菌剂BIT、MIT和卡松对这些芽孢杆菌的平均最 低抑菌浓度(MIC)分别为：10mg/L、14mg/L和15mg/L，呈现一定的耐药性，而菌体抗药性的提 高，一个非常重要的因素就是由于生物被膜的形成，生物被膜是细菌的聚集体，它的形成可 以使菌体的抗药性提高10-1000倍，另外，枯草芽孢杆菌的出现导致日化产品的性状发生改 变，如使日化产品变得粘稠等，因此，迫切需要寻找一定的方法来防治枯草芽孢杆菌及其生 物膜在特殊领域的污染。 目前，抑制枯草芽孢杆菌生长和繁殖的方法主要是加入一定浓度的化学杀菌剂， 但是由于化学杀菌剂的长期和不正当使用，使枯草芽孢杆菌对其产生了抗药性，从而引发 健康风险和经济损失；虽然，目前也有使用噬菌体、蛋白酶、天然产物等防控枯草芽孢杆菌， 但由于效果差、作用时间长、适用范围窄等原因，没有得到大规模应用。
技术实现要素：
本发明针对虽然枯草芽孢杆菌一直以来被作为有益菌在农业、发酵工业和畜牧业 等领域得到了广泛的应用，但在某些领域或者产品中如日化产品和工业制品等，枯草芽孢 杆菌的出现特别是其生物被膜的形成往往会导致一系列的问题和危害的不足，根据以菌治 膜的思路，通过引入其它菌株来有效控制枯草芽孢杆菌的生物被膜形成，提供一种高效抑 制枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法。 本发明通过引入枯草芽孢杆菌的抑制菌株即大肠杆菌特定基因敲除子，通过菌菌 互作抑制枯草芽孢杆菌生物膜的形成，而引入的菌株具有较低的抗药性，易于根除，以菌治 菌和以菌抑膜可以作为一种新的腐败菌防治策略和技术。 本发明的抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法，其特征在于，向枯草芽孢杆菌 中加入大肠杆菌基因敲除子从而抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成，所述的大肠杆菌基因敲 除子为大肠杆菌BW25113敲除子ΔatpA、ΔatpB、ΔatpC、ΔatpD、ΔatpH、ΔdcuA、ΔguaA、 Δlpd、ΔpurA、ΔsucB、ΔubiE、ΔubiH和ΔygaP中的至少一种。 3 CN 111548956 A 说　明　书 2/6 页 优选，所述的加入是通过将所述的大肠杆菌基因敲除子与所述的枯草芽孢杆菌在 液相中接触来进行的。 优选，所述的加入是通过将所述的大肠杆菌基因敲除子与所述的枯草芽孢杆菌混 合来进行的。 优选，所述的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌PY79。 本发明还提供以大肠杆菌BW25113敲除子ΔatpA、ΔatpB、ΔatpC、ΔatpD、Δ atpH、ΔdcuA、ΔguaA、Δlpd、ΔpurA、ΔsucB、ΔubiE、ΔubiH和ΔygaP中的至少一种作为 活性成分的菌剂在抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成中的应用。 优选，所述的菌剂，是将大肠杆菌BW25113敲除子ΔatpA、ΔatpB、ΔatpC、ΔatpD、 ΔatpH、ΔdcuA、ΔguaA、Δlpd、ΔpurA、ΔsucB、ΔubiE、ΔubiH和ΔygaP中的至少一种接 种于LB培养基中，25℃-37℃培养得到的。 本发明中所使用的大肠杆菌BW25113敲除子，包括：ΔatpA、ΔatpB、ΔatpC、Δ atpD、ΔatpH、ΔdcuA、ΔguaA、Δlpd、ΔpurA、ΔsucB、ΔubiE、ΔubiH和ΔygaP，上述的敲 除子中依次对应敲除的基因为：atpA是ATP合成酶F1复合体α亚单位(ATP  synthase  F1  alpha  subunit)、atpB是ATP合成酶Fo复合体亚单位(ATP  synthase  Fo  complex  subunit)、atpC是ATP合成酶F1复合体ε亚单位(ATP  synthase  F1  complex  subunit  epsilon)、atpD是ATP合成酶F1复合体β亚单位(ATP  synthase  F1  complex  subunit  beta)、atpH是ATP合成酶F1复合体δ亚单位(ATP  synthase  F1  complex  subunit  delta)、 dcuA是C4二羧酸转运体(C4-dicarboxylate  transporter)、guaA是鸟嘌呤核苷酸合成酶 (GMP  synthetase)、lpd是脂酰胺脱氢酶(Lipoamide  dehydrogenase)、purA是腺苷酸琥珀 酸合成酶(Ad e n y l o s u c c i n a t e  s y n t h e ta s e)、s u c B是二氢脂酰转琥珀酰酶 (Dihydrolipoyltranssuccinylase)、ubiE是双功能2-辛烷基-6-甲氧基-1,4-苯醌甲基化 酶和S-腺苷甲硫氨酸：2-DMK甲基转移酶(Bifunctional  2-octaprenyl-6-methoxy-1 ,4- benzoquinone  methylase  and  S-adenosylmethionine:2-DMK  methyltransferase)、ubiH 是2-辛烷基-6-甲氧基苯酚羟化酶(2-octaprenyl-6-methoxyphenol  hydroxylase)、ygaP 是硫代硫酸盐硫转移酶(Thiosulfate  sulfurtransferase)。这些敲除子各自的生物膜形 成能力较差，与枯草芽孢杆菌混合以后，可将枯草芽孢杆菌生物被膜形成能力降低82％- 99％。 本发明所提到的上述大肠杆菌BW25113敲除子，全部来自于大肠杆菌BW25113  keio单基因突变体文库，无需自己通过基因操作获得，可以通过商业渠道购买得到，然后， 进行简单的实验室活化和复壮，即可使用，简单高效。 本发明所述的方法不涉及复杂的基因操作，只要具有基本的微生物学知识，就可 以使用，易于在实际生产中推广使用。 本发明所用的大肠杆菌BW25113敲除子ΔatpA、ΔatpB、ΔatpC、ΔatpD、ΔatpH、 ΔdcuA、ΔguaA、Δlpd、ΔpurA、ΔsucB、ΔubiE、ΔubiH、ΔygaP，可以从网址：https:// horizondiscovery.com/en/products/gene-modulation/overexpression-reagents/non- mammalian/PIFs/E-coli-Keio-Knockouts上购买得到；上述的敲除子本申请人也持有，保 证自本发明的申请日起20年内向公众提供。 4 CN 111548956 A 说　明　书 3/6 页 附图说明 图1是枯草芽孢杆菌浮游菌和大肠杆菌敲除子混合(A)以及敲除子本身的生物膜 (B)形成量；注：柱子上方的数字为均值。