技术摘要：
本发明涉及用于产生睫状边缘带样结构的方法。提供用于产生包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体的方法等，所述方法的特征在于包括在含有Wnt信号传递途径激动剂的无血清培养基或血清培养基中，将包含视网膜组织的细胞聚集体仅培养一段时间直至出现表达RPE65基因的细胞，并 全部
背景技术：
已知体内视网膜的睫状边缘带为结构形成和视网膜组织维持执行重要功能（参见 例如，非专利文件1），并且例如，已知Rdh10基因（非专利文件2）和Otx1基因（非专利文件1） 是睫状边缘带的基因标志物。然而，没有已知的用于从多能干细胞高效产生该睫状边缘带 样结构的方法。 [文件列表] [非专利文件] 专利文件1：W . Zac Stephens , Megan Senecal , Minhtu Nguyen ,和Tatjana Piotrowski (2010) Loss of adenomatous polyposis coli (apc) Results in an Expanded Ciliary Marginal Zone in the Zebrafish Eye. DEVELOPMENTAL DYNAMICS 卷:239, 页:2066-2077 专利文件2：Fumi Kubo和Shinichi Nakagawa (2009) Hairy1 acts as a node downstream of Wnt signaling to maintain retinal stem cell-like progenitor cells in the chick ciliary marginal zone. Development 卷:136, 页:1823-1833。
技术实现要素：
本发明待解决的问题 已存在开发用于高效产生睫状边缘带样结构的方法的期望。 解决问题的方法 考虑到该情形，本发明人已经进行了深入研究并实现本发明。 尤其是，本发明提供： 1. 用于产生包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体的方法，其包括在各自含有作用于 Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清培养基中，将包含视网膜组织的细胞聚集体 仅在出现表达RPE65基因的细胞之前培养一段时间，随后在各自不含有作用于Wnt信号途径 的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养因此获得的“其中不出现表达RPE65基因的 细胞的细胞聚集体”的步骤，在所述视网膜组织中Chx10阳性细胞以所述组织的20%或更高 的比例存在（在下文中，有时候称为本发明的产生方法）； 2. 上述项目1的产生方法，其中出现表达RPE65基因的细胞之前的一段时间是这样的 一段时间，在所述时间内Chx10阳性细胞以组织的50%-1%的比例存在于视网膜组织中，并且 其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体是其中Chx10阳性细胞以组织的50%-1%的 4 CN 111607557 A 说 明 书 2/14 页 比例存在于视网膜组织中的细胞聚集体； 3. 上述项目2的产生方法，其中在各自不含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培 养基或含血清培养基中培养因此获得的“其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集 体”，直至视网膜组织中存在的Chx10阳性细胞的比例达到所述组织的50%或更高； 4. 上述项目1-3中任一项的产生方法，其中所述视网膜组织来源于人多能干细胞； 5. 通过上述项目1-4中任一项的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集 体作为用于评估毒性或药物效力的试剂的用途； 6. 通过上述项目1-4中任一项的产生方法产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集 体作为用于移植的生物材料的用途； 等。 发明效果 根据本发明的产生方法，可以高效产生睫状边缘带样结构。在通过本发明的产生方法 产生的包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体中，所述睫状边缘带样结构充当前进区起功 能，并且可以高效形成在睫状边缘带样结构附近具有层结构的连续神经视网膜。 附图说明 图1是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 浮培养之前细胞聚集体的冷冻切片中表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像。 图2是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 浮培养之前细胞聚集体的冷冻切片使用抗Chx10抗体的荧光免疫染色图像。图1（显示全部 视网膜组织的存在）和图2（显示Chx10阳性细胞的存在）的比较证实了加入作用于Wnt信号 途径的物质之前在全部的约40%中Chx10阳性细胞的存在。 图3是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 浮培养后的第3天细胞聚集体的冷冻切片中表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像。 图4是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 浮培养后的第3天细胞聚集体的冷冻切片使用抗Chx10抗体的荧光免疫染色图像。图3（显示 全部视网膜组织的存在）和图4（显示Chx10阳性细胞的存在）的比较揭示了向培养基中加入 作用于Wnt信号途径的物质后的3天中仅在全部的约3%中的Chx10阳性细胞的存在，由此可 以证实清楚的降低。 图5是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养39天后细 胞聚集体的冷冻切片中表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像。 图6是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养39天后细 胞聚集体的冷冻切片使用抗Rdh10抗体的荧光免疫染色图像。图5（显示全部视网膜组织的 存在）和图6（显示Rdh10阳性细胞的存在）的比较证实了通过加入作用于Wnt信号途径的物 质培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中培养得到的Rdh10 阳性细胞的存在。 图7是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 5 CN 111607557 A 说 明 书 3/14 页 浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养50天后细 胞聚集体的冷冻切片中表达Rax基因的细胞的GFP荧光图像。 图8是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养50天后细 胞聚集体的冷冻切片使用抗Rdh10抗体的荧光免疫染色图像。 图9是这样的图，其显示了在含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬 浮培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血清培养基中悬浮培养50天后细 胞聚集体的冷冻切片使用抗Otx1抗体的荧光免疫染色图像。图7（显示全部视网膜组织的存 在）、图8（显示Rdh10阳性细胞的存在）和图9（显示Otx1阳性细胞的存在）的比较证实了通过 加入作用于Wnt信号途径的物质培养3天，随后在不含有作用于Wnt信号途径的物质的含血 清培养基中培养得到的Rdh10阳性细胞和Otx1阳性细胞的存在。 图10显示了含有在如下所示制备的细胞聚集体中含有的睫状边缘带样结构的区 域的冷冻切片的染色图像。将在悬浮培养开始后第18天的细胞聚集体在含有作用于Wnt信 号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，并且在不含有作用于Wnt信号途径的物质的 含血清培养基中悬浮培养46天，然后在存在BrdU的情况下培养1天，然后在不存在BrdU的情 况下培养13天，并在存在EdU (Invitrogen)的情况下培养1天。制备所获得的细胞聚集体的 冷冻切片并使其进行使用抗Ki67抗体（左图）或抗BrdU抗体（右图）的荧光免疫染色或利用 EdU的显色反应（中间的图）。 图11显示了含有在如下所示制备的细胞聚集体中含有的睫状边缘带样结构的区 域的冷冻切片的染色图像。将在悬浮培养开始后第18天的细胞聚集体在含有作用于Wnt信 号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，并且在不含有作用于Wnt信号途径的物质的 含血清培养基中悬浮培养46天，然后在存在BrdU的情况下培养1天，然后在不存在BrdU的情 况下培养13天，并在存在EdU (Invitrogen)的情况下培养1天，在不存在EdU的情况下进一 步培养13天。制备所获得的细胞聚集体的冷冻切片并使其进行使用抗Ki67抗体（左图）或抗 BrdU抗体（右图）或抗Rdh10抗体（下图）的荧光免疫染色，或利用EdU的显色反应（中间的 图）。 图12是这样的图，其显示了通过使在悬浮培养开始后第18天的细胞聚集体在含有 作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基中悬浮培养3天，并在不含有作用于Wnt信号途 径的物质的含血清培养基中悬浮培养75天获得的细胞聚集体的分析。 图12A是所述条件下细胞聚集体的实例，并显示了没有睫状边缘带样结构(CMZ)的 细胞聚集体的相差图像（A，左列，上图）、没有睫状边缘带样结构的细胞聚集体中表达Crx基 因的细胞的GFP荧光图像（A，左列，下图）、含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体的相差图像 （A，右列，上图）、和含有睫状边缘带样结构的细胞聚集体中表达Crx基因的细胞的GFP荧光 图像（A，右列，下图）。 图12B是与没有睫状边缘带样结构(CMZ-)的细胞聚集体和具有睫状边缘带样结构 (CMZ )的细胞聚集体相关的图像，其显示了通过使用表达Crx基因的细胞的形成作为指标， 在不少于10%的细胞聚集体周围中含有连续的分层神经视网膜的细胞聚集体比例的测定结 果。 6 CN 111607557 A 说 明 书 4/14 页
