技术摘要：
本发明公开了运用蒸发光散射检测器通过高效液相色谱仪建立灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸成分的分析测定方法。涉及样品提取条件的优化、色谱柱的选择、色谱条件的优化、检测器参数的优化等，同时对建立的方法进行了方法学验证。本发明建立的灵芝孢子粉及其产品中甾 全部
背景技术：
灵芝是一种药用价值很高的名贵真菌，灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌褶弹射出 来的卵形生殖细胞，含有脂肪酸类、三萜酸类、甾醇、多糖、核苷、生物碱等多种化学成分。灵 芝孢子粉具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性，越来越多地被用于保健和医药产品 之中。近年来，随着孢子粉收集和破壁技术的发展，灵芝孢子粉的药理作用已经受到消费者 的广泛认可，目前灵芝孢子粉保健食品的市场占有率非常高，主要以灵芝孢子粉散剂和灵 芝孢子油胶囊为主。 现有的关于灵芝孢子粉的质量评价标准比较缺乏，常用灵芝子实体中的活性成分 三萜或多糖作为质控指标，大量的研究已经证明，子实体中相关成分的测定方法并不适合 灵芝孢子粉的测定，结果偏差大、呈现假阳性。为了更客观的评价和反映各种因素等对灵芝 孢子粉的质量影响、控制其产品质量、规范产品优劣等级，亟需寻找更多可评价灵芝孢子粉 质量的指标性成分，并建立相应的分析定量方法，为灵芝孢子粉及其产品的质量评价提供 依据。 灵芝孢子粉中脂溶性成分的含量高于20％，主要包括甘油三酯类化合物、游离脂 肪酸、甾醇、脂溶性维生素和极微量的三萜类成分等。有学者认为，灵芝孢子粉尤其是灵芝 孢子油产品的药理作用与其含有丰富的脂肪酸特别是不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸有密切 关系。另有研究表明，甾醇的抗肿瘤作用不容忽视，已有多种甾醇类单体成分报道具有抗肿 瘤活性，如麦角甾醇、过氧化麦角甾醇等。除麦角甾醇外，多数甾醇和游离脂肪酸类成分均 没有紫外吸收，目前甾醇的测定常将样品进行皂化或衍生化处理后通过气相色谱-质谱联 用(GC-MS)进行测定，测定方法繁琐、副反应问题多，且设备昂贵、使用普及率低。本发明克 服了现有甾醇及脂肪酸类分析方法的局限性，运用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱 法对灵芝孢子粉及其产品中的甾醇和脂肪酸成分的含量进行测定，方法简单、成本低、适用 范围广、准确度高、特异性强，为评价灵芝孢子粉及其产品的质量提供科学依据。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有甾醇及脂肪酸类分析方法的局限性，提供一种分析成本 低、适用范围广、准确度高、特异性强的灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC 测定方法。 本发明涉及一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，包 括如下步骤：将灵芝孢子粉及其产品加入溶剂提取后，运用蒸发光散射检测器，通过高效液 相色谱法对灵芝孢子粉及其产品中的甾醇和脂肪酸成分的含量进行测定。 4 CN 111579662 A 说 明 书 2/7 页 本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，具体操 作过程包括以下步骤： (1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，将灵芝孢子粉或相关产品加入溶剂浸提， 得到浸提液，离心，取上清液，经过滤后得到待测样品溶液； (2)高效液相色谱检测步骤：采用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱仪对待测 样品溶液进行高效液相色谱分析； (3)指标成分是甾醇和脂肪酸类成分：其中甾醇类成分为啤酒甾醇、麦角甾醇过氧 化物、麦角甾醇和星鱼甾醇；脂肪酸类成分为油酸、亚油酸、棕榈酸。 具体地，本发明涉及灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提方法包括以下步骤： 所用浸提溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、异丙醇、己烷：异丙醇(V/V＝ 3：2)、己烷：乙醇(V/V＝1：1)中的一种；提取方式为超声提取、加热震荡提取，优选超声提 取；提取时间为10-90min，优选30min；料液比为1：10-1：50，其中孢子粉样品优选1：10，孢子 油样品优选1：30；浸提次数包括一次浸提或反复浸提。 浸提液的处理包括以下步骤：提取完成后，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12000r/ min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，备用。 进一步，本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方 法，设计的高效液相色谱法包括以下步骤： 检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱为反相C18色谱柱，流动相溶液成分为乙腈- 甲醇-水-异丙醇四相梯度洗脱，其中水中冰醋酸的浓度为0.00％-0.02％，优选0.01％；柱 温为20-40℃，优选30℃；流速0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min；进样体积为5-50μL，优选20μ L。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4 .6mm×250mm，5μm)色谱柱或Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱。 具体地，蒸发光散射检测器的设定包括以下参数： 增益为100-1000，优选500；气体压力为20-40psi，优选25psi；漂移管温度为50-80 ℃，优选60℃；喷雾器模式为加热模式，加热功率为50％-80％，优选65％。 进一步地，流动相的洗脱程序为： (A)乙腈 (B)水 (C)甲醇 (D)异丙醇(V/V/V/V)＝100％(体积) 0→10min，A/B/C/D＝40/0/60/0→A/B/C/D＝60/0/40/0； 10→25min，A/B/C/D＝60/0/40/0→A/B/C/D＝68/0/32/0； 25→32min，A/B/C/D＝68/0/32/0→A/B/C/D＝60/20/20/0； 32→40min，A/B/C/D＝60/20/20/0→A/B/C/D＝80/20/0/0； 40→55min，A/B/C/D＝80/20/0/0→A/B/C/D＝100/0/0/0； 55→65min，A/B/C/D＝100/0/0/0→A/B/C/D＝100/0/0/0； 65→67min，A/B/C/D＝100/0/0/0→A/B/C/D＝20/0/0/80； 67→80min，A/B/C/D＝20/0/0/80→A/B/C/D＝20/0/0/80； 80→82min，A/B/C/D＝20/0/0/80→A/B/C/D＝40/0/60/0； 82→95min，A/B/C/D＝40/0/60/0→A/B/C/D＝40/0/60/0。 本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，所述高 效液相色谱法还包括以下具体步骤： 5 CN 111579662 A 说 明 书 3/7 页 1)系列标准品溶液的配制：用甲醇配制含有所述4种甾醇化合物和3种脂肪酸类成 分各适量的混合标准品溶液，并依次用甲醇稀释成系列浓度梯度，备用。 2)各待测组分的定性：将各甾醇及脂肪酸类成分单组分及混合标准品溶液进行 HPLC分析，根据各单组分的保留时间定性； 3)标准曲线的绘制：取步骤1)中的系列标准品溶液，按照本发明所述色谱条件进 行测定，计算峰面积，以各标准品质量浓度的对数(lgC)为横坐标，以峰面积的对数(lgA)为 纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。 附图说明 图1、洗脱程序优化前连续进样分析的HPLC图谱 图2、灵芝孢子油样品的HPLC图谱(局部放大) 图3、灵芝孢子油样品完整洗脱程序(乙腈-水-甲醇-异丙醇)下的HPLC图谱图2的 解释：在图2中，1-7分别代表：1、啤酒甾醇；2、亚油酸；3、棕榈酸；4、油酸；5、麦角甾醇过氧化 物；6、麦角甾醇；7、星鱼甾醇。 表1、乙腈-水-甲醇-异丙醇梯度洗脱程序 表2-1、各待测组分的方法学数据 6 CN 111579662 A 说 明 书 4/7 页 表2-2、各待测组分的方法学数据 表3、破壁孢子粉样品中甾醇和脂肪酸的含量(n＝2,mg/g) 表4、孢子油样品中甾醇和脂肪酸的含量(n＝2,mg/g) 7 CN 111579662 A 说 明 书 5/7 页
本发明公开了运用蒸发光散射检测器通过高效液相色谱仪建立灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸成分的分析测定方法。涉及样品提取条件的优化、色谱柱的选择、色谱条件的优化、检测器参数的优化等，同时对建立的方法进行了方法学验证。本发明建立的灵芝孢子粉及其产品中甾 全部
背景技术：
灵芝是一种药用价值很高的名贵真菌，灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌褶弹射出 来的卵形生殖细胞，含有脂肪酸类、三萜酸类、甾醇、多糖、核苷、生物碱等多种化学成分。灵 芝孢子粉具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性，越来越多地被用于保健和医药产品 之中。近年来，随着孢子粉收集和破壁技术的发展，灵芝孢子粉的药理作用已经受到消费者 的广泛认可，目前灵芝孢子粉保健食品的市场占有率非常高，主要以灵芝孢子粉散剂和灵 芝孢子油胶囊为主。 现有的关于灵芝孢子粉的质量评价标准比较缺乏，常用灵芝子实体中的活性成分 三萜或多糖作为质控指标，大量的研究已经证明，子实体中相关成分的测定方法并不适合 灵芝孢子粉的测定，结果偏差大、呈现假阳性。为了更客观的评价和反映各种因素等对灵芝 孢子粉的质量影响、控制其产品质量、规范产品优劣等级，亟需寻找更多可评价灵芝孢子粉 质量的指标性成分，并建立相应的分析定量方法，为灵芝孢子粉及其产品的质量评价提供 依据。 灵芝孢子粉中脂溶性成分的含量高于20％，主要包括甘油三酯类化合物、游离脂 肪酸、甾醇、脂溶性维生素和极微量的三萜类成分等。有学者认为，灵芝孢子粉尤其是灵芝 孢子油产品的药理作用与其含有丰富的脂肪酸特别是不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸有密切 关系。另有研究表明，甾醇的抗肿瘤作用不容忽视，已有多种甾醇类单体成分报道具有抗肿 瘤活性，如麦角甾醇、过氧化麦角甾醇等。除麦角甾醇外，多数甾醇和游离脂肪酸类成分均 没有紫外吸收，目前甾醇的测定常将样品进行皂化或衍生化处理后通过气相色谱-质谱联 用(GC-MS)进行测定，测定方法繁琐、副反应问题多，且设备昂贵、使用普及率低。本发明克 服了现有甾醇及脂肪酸类分析方法的局限性，运用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱 法对灵芝孢子粉及其产品中的甾醇和脂肪酸成分的含量进行测定，方法简单、成本低、适用 范围广、准确度高、特异性强，为评价灵芝孢子粉及其产品的质量提供科学依据。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有甾醇及脂肪酸类分析方法的局限性，提供一种分析成本 低、适用范围广、准确度高、特异性强的灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC 测定方法。 本发明涉及一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，包 括如下步骤：将灵芝孢子粉及其产品加入溶剂提取后，运用蒸发光散射检测器，通过高效液 相色谱法对灵芝孢子粉及其产品中的甾醇和脂肪酸成分的含量进行测定。 4 CN 111579662 A 说 明 书 2/7 页 本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，具体操 作过程包括以下步骤： (1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，将灵芝孢子粉或相关产品加入溶剂浸提， 得到浸提液，离心，取上清液，经过滤后得到待测样品溶液； (2)高效液相色谱检测步骤：采用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱仪对待测 样品溶液进行高效液相色谱分析； (3)指标成分是甾醇和脂肪酸类成分：其中甾醇类成分为啤酒甾醇、麦角甾醇过氧 化物、麦角甾醇和星鱼甾醇；脂肪酸类成分为油酸、亚油酸、棕榈酸。 具体地，本发明涉及灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提方法包括以下步骤： 所用浸提溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、异丙醇、己烷：异丙醇(V/V＝ 3：2)、己烷：乙醇(V/V＝1：1)中的一种；提取方式为超声提取、加热震荡提取，优选超声提 取；提取时间为10-90min，优选30min；料液比为1：10-1：50，其中孢子粉样品优选1：10，孢子 油样品优选1：30；浸提次数包括一次浸提或反复浸提。 浸提液的处理包括以下步骤：提取完成后，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12000r/ min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，备用。 进一步，本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方 法，设计的高效液相色谱法包括以下步骤： 检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱为反相C18色谱柱，流动相溶液成分为乙腈- 甲醇-水-异丙醇四相梯度洗脱，其中水中冰醋酸的浓度为0.00％-0.02％，优选0.01％；柱 温为20-40℃，优选30℃；流速0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min；进样体积为5-50μL，优选20μ L。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4 .6mm×250mm，5μm)色谱柱或Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱。 具体地，蒸发光散射检测器的设定包括以下参数： 增益为100-1000，优选500；气体压力为20-40psi，优选25psi；漂移管温度为50-80 ℃，优选60℃；喷雾器模式为加热模式，加热功率为50％-80％，优选65％。 进一步地，流动相的洗脱程序为： (A)乙腈 (B)水 (C)甲醇 (D)异丙醇(V/V/V/V)＝100％(体积) 0→10min，A/B/C/D＝40/0/60/0→A/B/C/D＝60/0/40/0； 10→25min，A/B/C/D＝60/0/40/0→A/B/C/D＝68/0/32/0； 25→32min，A/B/C/D＝68/0/32/0→A/B/C/D＝60/20/20/0； 32→40min，A/B/C/D＝60/20/20/0→A/B/C/D＝80/20/0/0； 40→55min，A/B/C/D＝80/20/0/0→A/B/C/D＝100/0/0/0； 55→65min，A/B/C/D＝100/0/0/0→A/B/C/D＝100/0/0/0； 65→67min，A/B/C/D＝100/0/0/0→A/B/C/D＝20/0/0/80； 67→80min，A/B/C/D＝20/0/0/80→A/B/C/D＝20/0/0/80； 80→82min，A/B/C/D＝20/0/0/80→A/B/C/D＝40/0/60/0； 82→95min，A/B/C/D＝40/0/60/0→A/B/C/D＝40/0/60/0。 本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，所述高 效液相色谱法还包括以下具体步骤： 5 CN 111579662 A 说 明 书 3/7 页 1)系列标准品溶液的配制：用甲醇配制含有所述4种甾醇化合物和3种脂肪酸类成 分各适量的混合标准品溶液，并依次用甲醇稀释成系列浓度梯度，备用。 2)各待测组分的定性：将各甾醇及脂肪酸类成分单组分及混合标准品溶液进行 HPLC分析，根据各单组分的保留时间定性； 3)标准曲线的绘制：取步骤1)中的系列标准品溶液，按照本发明所述色谱条件进 行测定，计算峰面积，以各标准品质量浓度的对数(lgC)为横坐标，以峰面积的对数(lgA)为 纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。 附图说明 图1、洗脱程序优化前连续进样分析的HPLC图谱 图2、灵芝孢子油样品的HPLC图谱(局部放大) 图3、灵芝孢子油样品完整洗脱程序(乙腈-水-甲醇-异丙醇)下的HPLC图谱图2的 解释：在图2中，1-7分别代表：1、啤酒甾醇；2、亚油酸；3、棕榈酸；4、油酸；5、麦角甾醇过氧化 物；6、麦角甾醇；7、星鱼甾醇。 表1、乙腈-水-甲醇-异丙醇梯度洗脱程序 表2-1、各待测组分的方法学数据 6 CN 111579662 A 说 明 书 4/7 页 表2-2、各待测组分的方法学数据 表3、破壁孢子粉样品中甾醇和脂肪酸的含量(n＝2,mg/g) 表4、孢子油样品中甾醇和脂肪酸的含量(n＝2,mg/g) 7 CN 111579662 A 说 明 书 5/7 页
