技术摘要：
本发明属于疫苗制备技术领域，具体为一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒株及其应用，本发明所述的弱毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201867。利用本发明弱毒株制备的活疫苗，可以预防草鱼呼肠孤病毒II型引起的疾病，对于同因型的免疫保护效果注射使用时达到95%以上，浸泡免疫是达 全部
背景技术：
草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水养殖鱼类，在我国已有超过 60年的养殖历史，也是世界上重要的淡水鱼品种之一。2018年，淡水鱼总产量2959.83万吨, 其中草鱼产量为534.5万吨，占淡水养殖品种总产量的18.4％，产值达50亿以上，居淡水鱼 养殖品种首位，具有重要的经济地位。由草鱼呼肠孤病毒(Grass Crap Reovirus，GCRV)引 起的草鱼出血病(grass carp hemorrhage disease，GCHD)是造成草鱼死亡的最主要的病 原，其流行广泛、发病率高、死亡率高，严重威胁着草鱼养殖业。GCRV隶属呼肠孤病毒科 (Reoviridae)，水生动物呼肠孤病毒属(Aquareovirus)，呈正二十面体对称球形颗粒，直径 为65～72nm，无囊膜，具有双层衣壳，GCRV基因组由11条分节段的双链RNA(ds RNA) 组成。 根据基因序列的不同将GCRV大致分为I、II和III 3个基因型。目前以GCRV-II型为主要流行 株，对草鱼的致病性强，致死率高，大约占了95％以上。因此，目前开发针对流行基因型GCRV II型的疫苗具有积极的意义，对草鱼养殖过程中不断发生的草鱼出血病的预防具有明显优 势。 针对由GCRV-II引起的草鱼出血病，目前仍没有有效的治疗措施，在生产养殖上， 主要以预防为主。有关GCRV疫苗的研究，目前主要集中在全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基 因工程疫苗三个方面，基因工程疫苗又包括亚单位疫苗、DNA疫苗等。最早用于预防草鱼出 血病的灭活疫苗是在20世纪60年代研发的“组织浆灭活疫苗”。随后，通过细胞培养获得的 GCRV灭活疫苗的研制取得显著的成就。但灭活疫苗在灭活过程中可能会损害或改变有效的 抗原决定簇，产生的免疫效果维持时间短，不产生局部抗体，需要多次免疫等缺点。基因工 程疫苗具有抗体出现早、滴度高、持续时间长等优点，但是在使用过程中容易被动物体降 解，稳定性弱，制备过程复杂，存在基因突变的风险，虽然针对GCRV-II的基因工程疫苗种类 繁多，但目前仍处于实验室研究阶段。 弱毒疫苗病原可在免疫动物体内繁殖，免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便。 因此。在实际生产过程中，主要免疫的多为减毒疫苗，细胞弱毒疫苗的应用，对减少草鱼出 血病的发生起到了积极的作用。而市面上获得法规许可的草鱼出血病疫苗均是针对GCRV-Ⅰ 型病毒。而主要流行则为II型GCRV，现有疫苗已难于满足当前草鱼出血病防控的需求，急需 要针对流行株型开发相应的免疫防控产品。 弱毒疫苗病原可在免疫动物体内繁殖，免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便。 因此。自然弱毒株是在自然界中存在的，非人为改造的菌株，比目前以基因工程手段构建的 缺失弱毒菌株更加稳定，不易产生毒力返强。 目前关于II型GCRV弱毒疫苗的报道较少，高彩霞等人报道分离获得了一个II型 GCRV弱毒株，该弱毒株命名为草鱼呼肠孤病毒II型CQ180701(高彩霞等，两株Ⅱ型草鱼呼肠 3 CN 111593027 A 说 明 书 2/7 页 孤病毒的分离、鉴定及生物学特性比较，水产学报，2020《；两株Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒新分离 株生物学特性的比较》，2018年中国水产学会学术年会论文摘要集，高彩霞等)，这两篇中涉 及到的CQ180701为同一株弱毒株。针对上述弱毒株，依然存在问题，一是该弱毒株可以导致 稀有鮈鲫10％左右的死亡率，存在一定的毒力；二是，其对草鱼强度毒株攻击的免疫保护率 为81％，保护力还有待提高。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒II型弱毒株，所述毒株已于2018 年11月 30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD1108， 保藏编号：CCTCC NO：V201867，地址：中国武汉武汉大学。 本发明的另一个目的在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒II型(本发明或称为GCRV II-GD1207)的应用，该毒株为II型草鱼呼肠孤病毒的自然分离弱毒株，利用该毒株可用于 制备草鱼呼肠孤病毒II型的弱毒活疫苗，制得的疫苗无致病性、免疫原性好、刺激抗体迅 速，保护力强。 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案： 草鱼呼肠孤病毒II型的分离、筛选和鉴定： 申请人自广东省佛山市三水区一草鱼养殖场健康草鱼肾脏组织中分离一株病毒， 经细胞分离、电镜观察、全基因组带型分析、PCR扩增和部分基因节段序列测定鉴定证明为 II型草鱼呼肠孤病毒。所述毒株已于2018年11月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏， 分类命名：草鱼呼肠孤病毒II型，保藏编号：CCTCC NO：V201867，地址：中国武汉武汉大学。 本发明提供的草鱼呼肠孤病毒II型的生物学特性鉴定如下： 该病毒在pH2.6-8.0的广泛酸碱范围内较为稳定，病毒在56℃左右30min和在4℃ 保存 1个月仍保存其传染性，对有机溶剂(如氯仿、乙醚)、非离子去污剂等具有很大的抵抗 力；病毒提纯后分别经DNA酶、RNA酶和绿豆核酸酶消化，证实为双链RNA(dsRNA)病毒。病毒 在CIK、CO等细胞上传代培养不产生CPE，超薄切片在电镜下观察，细胞胞浆中有大量病毒粒 子呈散在分布，无囊膜，近球形，平面图像呈六边形或近圆形、直径约70nm。用该病毒细胞培 养液感染草鱼不能导致其发病，也没有任何明显的临床症状，但病毒可以在草鱼体内复制 并诱导感染草鱼产生较强的免疫应答反应。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析其基因组带型显示，病毒基因组按分子量大小分为大、中、小三组，共有11 个dsRNA组成，呈现典型水生呼肠孤病毒基因组特征。对其S2节段编码的RNA 依赖性RNA聚 合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列进行分析发现，与其它 GCRV II分 离株的核苷酸和氨基酸序列同源性均在94％以上。 一种草鱼呼肠孤病毒II型的应用，包括利用该病毒制备由草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型引 起的疾病的疫苗，制备成治疗或预防草鱼出血病的疫苗，或者与其他有效成分制备成联合 疫苗。 优选的，上述应用中，所述疫苗的保护剂为明胶甘氨酸保护剂，即疫苗中明胶的终 含量为1-3wt.％，甘氨酸含量为1-3wt.％，疫苗的稀释液为20％(g/ml)氢氧化铝胶生理盐 水。 与现有技术相比，本发明具有以下优点： 4 CN 111593027 A 说 明 书 3/7 页 1 .本疫苗所用毒株对草鱼无致病性，能较快的刺激机体产生针对同基因型的抗 体。 2.本疫苗可以预防草鱼呼肠孤病毒II型引起的疾病，对于同因型的免疫保护效果 注射使用时达到95％以上，浸泡免疫是达到65％以上，口服免疫时达到40％以上，且不会对 机体产生应激反应，也不存在毒力返强的风险，可应用于由于草鱼呼肠孤病毒II型引发的 出血病，特别是草鱼、青鱼病毒性草鱼出血病的预防，降低草鱼、青鱼草鱼出血病的发病率， 提高草鱼、青鱼存活率。 3.本发明与已报道的草鱼呼肠孤病毒II型CQ180701弱毒株相比，本发明中的弱毒 株作为制备弱毒疫苗具用更为显著的优势，一是本发明中涉及的II型GCRV弱毒株对强度毒 株攻击的免疫保护率在95％以上，而CQ180701仅为81％；二是本发明中的弱毒株对草鱼和 稀有鮈鲫均没有任何毒性，而CQ180701可以导致稀有鮈鲫10％的死亡率，存在一定的毒力， 安全性是弱毒疫苗株最需要考虑。 附图说明 图1草鱼呼肠孤病毒II型分离的PCR鉴定结果示意图； 其中：泳道P1-P4分别为分离病毒盲传第1、2、3和4代病毒原液，NC为未感染病毒的 CIK阴性对照，M为DNA分质量标准。 图2草鱼呼肠孤病毒II型的电镜鉴定结果。 图3草鱼呼肠孤病毒II型基因组的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。 图4各组免疫鱼IgM特异性抗体水平。 图5各组免疫鱼免疫相关基因相对表达量。
本发明属于疫苗制备技术领域，具体为一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒株及其应用，本发明所述的弱毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201867。利用本发明弱毒株制备的活疫苗，可以预防草鱼呼肠孤病毒II型引起的疾病，对于同因型的免疫保护效果注射使用时达到95%以上，浸泡免疫是达 全部
背景技术：
草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水养殖鱼类，在我国已有超过 60年的养殖历史，也是世界上重要的淡水鱼品种之一。2018年，淡水鱼总产量2959.83万吨, 其中草鱼产量为534.5万吨，占淡水养殖品种总产量的18.4％，产值达50亿以上，居淡水鱼 养殖品种首位，具有重要的经济地位。由草鱼呼肠孤病毒(Grass Crap Reovirus，GCRV)引 起的草鱼出血病(grass carp hemorrhage disease，GCHD)是造成草鱼死亡的最主要的病 原，其流行广泛、发病率高、死亡率高，严重威胁着草鱼养殖业。GCRV隶属呼肠孤病毒科 (Reoviridae)，水生动物呼肠孤病毒属(Aquareovirus)，呈正二十面体对称球形颗粒，直径 为65～72nm，无囊膜，具有双层衣壳，GCRV基因组由11条分节段的双链RNA(ds RNA) 组成。 根据基因序列的不同将GCRV大致分为I、II和III 3个基因型。目前以GCRV-II型为主要流行 株，对草鱼的致病性强，致死率高，大约占了95％以上。因此，目前开发针对流行基因型GCRV II型的疫苗具有积极的意义，对草鱼养殖过程中不断发生的草鱼出血病的预防具有明显优 势。 针对由GCRV-II引起的草鱼出血病，目前仍没有有效的治疗措施，在生产养殖上， 主要以预防为主。有关GCRV疫苗的研究，目前主要集中在全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基 因工程疫苗三个方面，基因工程疫苗又包括亚单位疫苗、DNA疫苗等。最早用于预防草鱼出 血病的灭活疫苗是在20世纪60年代研发的“组织浆灭活疫苗”。随后，通过细胞培养获得的 GCRV灭活疫苗的研制取得显著的成就。但灭活疫苗在灭活过程中可能会损害或改变有效的 抗原决定簇，产生的免疫效果维持时间短，不产生局部抗体，需要多次免疫等缺点。基因工 程疫苗具有抗体出现早、滴度高、持续时间长等优点，但是在使用过程中容易被动物体降 解，稳定性弱，制备过程复杂，存在基因突变的风险，虽然针对GCRV-II的基因工程疫苗种类 繁多，但目前仍处于实验室研究阶段。 弱毒疫苗病原可在免疫动物体内繁殖，免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便。 因此。在实际生产过程中，主要免疫的多为减毒疫苗，细胞弱毒疫苗的应用，对减少草鱼出 血病的发生起到了积极的作用。而市面上获得法规许可的草鱼出血病疫苗均是针对GCRV-Ⅰ 型病毒。而主要流行则为II型GCRV，现有疫苗已难于满足当前草鱼出血病防控的需求，急需 要针对流行株型开发相应的免疫防控产品。 弱毒疫苗病原可在免疫动物体内繁殖，免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便。 因此。自然弱毒株是在自然界中存在的，非人为改造的菌株，比目前以基因工程手段构建的 缺失弱毒菌株更加稳定，不易产生毒力返强。 目前关于II型GCRV弱毒疫苗的报道较少，高彩霞等人报道分离获得了一个II型 GCRV弱毒株，该弱毒株命名为草鱼呼肠孤病毒II型CQ180701(高彩霞等，两株Ⅱ型草鱼呼肠 3 CN 111593027 A 说 明 书 2/7 页 孤病毒的分离、鉴定及生物学特性比较，水产学报，2020《；两株Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒新分离 株生物学特性的比较》，2018年中国水产学会学术年会论文摘要集，高彩霞等)，这两篇中涉 及到的CQ180701为同一株弱毒株。针对上述弱毒株，依然存在问题，一是该弱毒株可以导致 稀有鮈鲫10％左右的死亡率，存在一定的毒力；二是，其对草鱼强度毒株攻击的免疫保护率 为81％，保护力还有待提高。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒II型弱毒株，所述毒株已于2018 年11月 30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD1108， 保藏编号：CCTCC NO：V201867，地址：中国武汉武汉大学。 本发明的另一个目的在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒II型(本发明或称为GCRV II-GD1207)的应用，该毒株为II型草鱼呼肠孤病毒的自然分离弱毒株，利用该毒株可用于 制备草鱼呼肠孤病毒II型的弱毒活疫苗，制得的疫苗无致病性、免疫原性好、刺激抗体迅 速，保护力强。 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案： 草鱼呼肠孤病毒II型的分离、筛选和鉴定： 申请人自广东省佛山市三水区一草鱼养殖场健康草鱼肾脏组织中分离一株病毒， 经细胞分离、电镜观察、全基因组带型分析、PCR扩增和部分基因节段序列测定鉴定证明为 II型草鱼呼肠孤病毒。所述毒株已于2018年11月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏， 分类命名：草鱼呼肠孤病毒II型，保藏编号：CCTCC NO：V201867，地址：中国武汉武汉大学。 本发明提供的草鱼呼肠孤病毒II型的生物学特性鉴定如下： 该病毒在pH2.6-8.0的广泛酸碱范围内较为稳定，病毒在56℃左右30min和在4℃ 保存 1个月仍保存其传染性，对有机溶剂(如氯仿、乙醚)、非离子去污剂等具有很大的抵抗 力；病毒提纯后分别经DNA酶、RNA酶和绿豆核酸酶消化，证实为双链RNA(dsRNA)病毒。病毒 在CIK、CO等细胞上传代培养不产生CPE，超薄切片在电镜下观察，细胞胞浆中有大量病毒粒 子呈散在分布，无囊膜，近球形，平面图像呈六边形或近圆形、直径约70nm。用该病毒细胞培 养液感染草鱼不能导致其发病，也没有任何明显的临床症状，但病毒可以在草鱼体内复制 并诱导感染草鱼产生较强的免疫应答反应。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析其基因组带型显示，病毒基因组按分子量大小分为大、中、小三组，共有11 个dsRNA组成，呈现典型水生呼肠孤病毒基因组特征。对其S2节段编码的RNA 依赖性RNA聚 合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列进行分析发现，与其它 GCRV II分 离株的核苷酸和氨基酸序列同源性均在94％以上。 一种草鱼呼肠孤病毒II型的应用，包括利用该病毒制备由草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型引 起的疾病的疫苗，制备成治疗或预防草鱼出血病的疫苗，或者与其他有效成分制备成联合 疫苗。 优选的，上述应用中，所述疫苗的保护剂为明胶甘氨酸保护剂，即疫苗中明胶的终 含量为1-3wt.％，甘氨酸含量为1-3wt.％，疫苗的稀释液为20％(g/ml)氢氧化铝胶生理盐 水。 与现有技术相比，本发明具有以下优点： 4 CN 111593027 A 说 明 书 3/7 页 1 .本疫苗所用毒株对草鱼无致病性，能较快的刺激机体产生针对同基因型的抗 体。 2.本疫苗可以预防草鱼呼肠孤病毒II型引起的疾病，对于同因型的免疫保护效果 注射使用时达到95％以上，浸泡免疫是达到65％以上，口服免疫时达到40％以上，且不会对 机体产生应激反应，也不存在毒力返强的风险，可应用于由于草鱼呼肠孤病毒II型引发的 出血病，特别是草鱼、青鱼病毒性草鱼出血病的预防，降低草鱼、青鱼草鱼出血病的发病率， 提高草鱼、青鱼存活率。 3.本发明与已报道的草鱼呼肠孤病毒II型CQ180701弱毒株相比，本发明中的弱毒 株作为制备弱毒疫苗具用更为显著的优势，一是本发明中涉及的II型GCRV弱毒株对强度毒 株攻击的免疫保护率在95％以上，而CQ180701仅为81％；二是本发明中的弱毒株对草鱼和 稀有鮈鲫均没有任何毒性，而CQ180701可以导致稀有鮈鲫10％的死亡率，存在一定的毒力， 安全性是弱毒疫苗株最需要考虑。 附图说明 图1草鱼呼肠孤病毒II型分离的PCR鉴定结果示意图； 其中：泳道P1-P4分别为分离病毒盲传第1、2、3和4代病毒原液，NC为未感染病毒的 CIK阴性对照，M为DNA分质量标准。 图2草鱼呼肠孤病毒II型的电镜鉴定结果。 图3草鱼呼肠孤病毒II型基因组的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。 图4各组免疫鱼IgM特异性抗体水平。 图5各组免疫鱼免疫相关基因相对表达量。
