技术摘要：
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体pCALSm3及其应用。本发明的水稻ALS突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的植物遗传转化筛选载体利用水稻ALS突变基因的表达盒作为筛选标记，在愈伤组织筛选阶段使用嘧啶 全部
背景技术：
随着基因工程和分子生物学技术的迅速发展，转基因技术的应用范围越来越广 泛。转基因技术具有诸多的优点，如可拓宽可利用的基因资源，创造新种质资源；可对植物 性状进行定向定点变异和选择；为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径等。转基因作 物于1996年被批准商业化种植，截至2017年，全球累计批准23种转基因作物进行商业化生 产，涉及包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等在内的超过16类目标性状。据统 计，2017年全球26个国家和地区种植以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转 基因作物，面积达1.9亿公顷。转基因作物的大面积推广，为全球农业生产做出了巨大贡献。 目前，随着转基因产品的不断推广，人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但 对转基因产品的争议仍甚嚣尘上，转基因产品潜在的安全风险问题仍受到普遍关切，因此， 转基因产品需要严格的控制和监管。对于转基因作物的争议关键之一是筛选标记可能带来 的潜在风险，其转入植物后对靶标生物的抗性、所表达蛋白质的致敏性以及对受体作物本 身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响是未知的。目前使用最多的是抗生 素类和除草剂类筛选标记，如潮霉素-HPT筛选系统、卡纳霉素-NPTII筛选系统、草丁膦-Bar 筛选系统等。这些筛选标记绝大多数为细菌等来源的外源基因，这也是引起公众担忧的原 因之一。如果能用植物内源的基因作为筛选标记重新转化植物则可去除外源基因引起的风 险和担忧。 乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2.1.6)是催化植物体内支链 氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)合成起始步骤的关键酶(Herrera-Estrella L,Block M D,M essens E,et al.Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells.The EM BO Journal,1983,2(6):987-995.)，是植物特有酶，动物中没有该酶，故可 通过抑制ALS酶阻断支链氨基酸的生物合成，进而达到清除植物杂草的目的，而且对人畜无 害。目前，已针对该酶研发和应用多种除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰 胺类除草剂等。ALS氨基酸序列中某个位点的突变，可使得ALS蛋白结构发生改变，导致ALS 抑制剂无法结合ALS，使得ALS对除草剂的敏感性降低，从而对相关除草剂产生抗性(Tan S, Evans RR ,Dahm er M L ,et al .Imidazolinone-tolerant crops：history ,current status and future .Pest Management Science ,2005 ,61(3)：246-257；Duggleby RG , McCourt JA ,Guddat LW .Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase.Plant Physiology and Biochemistry,2008,46(3)：309- 324；Lee H ,Rustgi S,Kumar N ,et al .Single nucleotide mutation in the barley acetohydroxy acid synthase(AH AS)gene confers resistance to imidazolinone 4 CN 111593031 A 说 明 书 2/18 页 herbicides .Proceedings of the National Academy of Sciences ,2011 ,108(21)： 8909.)。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供水稻ALS突变蛋白及其编码基因；本发明的另一目的 是为解决目前基因遗传转化中因使用外源筛选标记而导致的潜在安全风险的问题，提供一 种利用植物内源基因作为筛选标记应用于植物遗传转化筛选的载体。 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 第一方面，本发明提供水稻ALS突变蛋白，所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白 在95、96、171、548和627位具有氨基酸突变。上述氨基酸位点的组合突变可显著提高ALS蛋 白对于ALS抑制剂类除草剂的抗性，进而赋予植物对多种ALS抑制剂类除草剂的高抗性。 本发明所述的ALS突变蛋白中，95、96、171、548和627位氨基酸突变可为将所述植 物的野生型ALS蛋白的95、96、171、548和627位氨基酸突变为丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和苏氨酸中的任意一种。 更优选地，所述ALS突变蛋白相对于野生型在95位由Gly突变为Ala，在96位由Ala 突变为Thr，在171位由Pro突变为Arg，在548位由Trp突变为Leu，在627位由Ser突变为Ile。 优选地，所述ALS突变蛋白具有如下(1)或(2)的氨基酸序列： (1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列； (2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得 到的能够使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性的ALS突变蛋白的氨基酸序列。 本发明提供的水稻ALS突变蛋白对于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰 胺类除草剂均具有较高的抗性。 本发明提供编码所述ALS突变蛋白的核酸。所有能够编码所述ALS突变蛋白的核酸 序列均在本发明的保护范围内，例如：如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。 本发明提供包含编码所述ALS突变蛋白的核酸的生物材料，具体可为包含编码所 述ALS突变蛋白的核酸的表达盒、载体、宿主细胞或转基因植物细胞系。 本发明提供所述ALS突变蛋白或编码所述ALS突变蛋白的核酸或含有所述核酸的 生物材料的如下任一应用： (1)在使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性或提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性 中的应用； (2)在制备转基因植物中的应用； (3)在植物种质资源改良中的应用； (4)在作为植物遗传转化的筛选标记或构建植物遗传转化筛选载体中的应用。 本发明所述ALS抑制剂类除草剂包括但不限于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲 类或磺酰胺类除草剂。 本发明所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生、芝麻、棉花、亚 麻子、茵宿、燕麦、油菜籽、大麦、黑麦、小米、烟草、青稞、拟南芥等。优选地，所述植物为水 稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生或小米。 5 CN 111593031 A 说 明 书 3/18 页 第二方面，本发明提供一种植物转基因筛选表达盒，其以植物内源基因作为筛选 标记，所述植物内源基因为ALS突变基因。 优选地，所述ALS突变基因为水稻ALS突变基因。 更优选地，所述水稻ALS突变基因(ALSm3)的的编码蛋白为本发明所述的ALS突变 蛋白。 本发明发现，序列如SEQ ID NO.1所示的ALS突变蛋白更适于作为筛选标记，在植 物基因转化过程中能够更高效地发挥筛选标记的功能。 所述水稻ALS突变基因(ALSm3)的核苷酸序列可为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序 列。 所述植物转基因筛选表达盒还包含用于启动和终止所述ALS突变基因转录的启动 子和终止子。 所述启动子可为植物组成型启动子或植物组织特异性启动子。 其中，所述植物组成型启动子可为水稻ALS基因启动子，水稻或玉米的Ubi启动子 或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子可为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。 优选地，所述启动子为水稻ALS基因启动子。 所述终止子可为在植物中可以终止基因转录的DNA序列，包括水稻ALS基因终止 子、Ubi终止子等。 优选地，所述终止子为水稻Ubi终止子。 本发明发现，采用水稻ALS基因启动子和Ubi终止子配合调控水稻ALS突变基因的 转录，能够更好地控制ALS突变基因的高效、稳定、适度表达，使得ALS基因突变体更好地发 挥筛选标记的功能。 作为本发明的优选方案，所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 本发明提供所述ALS突变基因在作为植物遗传转化的筛选标记中的应用。 基于上述植物转基因筛选表达盒，本发明进一步提供一种植物遗传转化筛选载 体，该载体含有上述的植物转基因筛选表达盒。 优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体，可通过克隆其他 表达盒进入该载体进行遗传转化；所述其他表达盒是指除上述的植物转基因筛选表达盒外 的表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达 盒等。 更优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体还包括一系列多克隆位点如AfeI、 AvrII、PmlI、SnaBI、AloI、PmeI等，以便后续克隆目的基因进入。 作为本发明的优选方案，本发明提供的植物遗传转化筛选载体为pCALSm3，其核苷 酸序列如SEQ ID NO.4所示。 上述植物遗传转化筛选载体可通过以下方法制备得到： (1)构建植物转基因筛选表达盒：将序列如SEQ ID NO.2所示的ALS突变基因置于 该基因自身启动子ALSpro驱动下表达，在其下游以水稻Ubi终止子终止表达，得到序列如 SEQ ID NO.3所示的植物转基因筛选表达盒； (2)将植物转基因筛选表达盒连入植物双元表达载体pC0310，获得植物遗传转化 6 CN 111593031 A 说 明 书 4/18 页 筛选载体。 本发明还提供所述水稻ALS突变蛋白或所述转基因筛选表达盒在作为植物遗传转 化筛选标记中的应用。 本发明还提供所述水稻ALS突变蛋白、所述转基因筛选表达盒或所述植物遗传转 化筛选载体在植物遗传中的应用。 所述的应用具体为：将植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物 愈伤组织后，在筛选阶段将愈伤组织接种到添加除草剂的筛选培养基中，进行抗性筛选。 所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑 乙烟酸。 优选地，所述筛选培养基中，含有0.25～1μmol/L双草醚、200～1000μg/L灭草烟或 300～1000μg/L咪唑乙烟酸。 所述筛选培养基中，优选含有0.3-0.4μmol/L双草醚，更优选地，含有0.4μmol/L双 草醚可获得良好的筛选效率；或优选含有200-500μg/L灭草烟，更优选地，含有250-300μg/L 灭草烟可获得良好的筛选效率；或优选含有300-500μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有400- 500μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的筛选效率。 进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载 体转入植物愈伤组织后的分化阶段，将从筛选培养基中得到的阳性愈伤采用含有除草剂的 分化培养基进行分化培养。 所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑 乙烟酸。 优选地，所述分化培养基中，含有0.05-1μmol/L双草醚、25-1000μg/L灭草烟或25- 1000μg/L咪唑乙烟酸。 所述分化培养基中，优选含有0.05-0.25μmol/L双草醚，更优选地，含有0.1μmol/L 双草醚可获得良好的分化效率；或优选含有30-100μg/L灭草烟，更优选地，含有50μg/L灭草 烟可获得良好的分化效率；或优选含有30-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有50μg/L咪唑 乙烟酸可获得良好的分化效率，同时有效抑制非转基因愈伤分化成苗。 进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载 体转入植物愈伤组织后的生根阶段，将分化培养得到的阳性苗采用含除草剂的生根培养基 进行生根培养。 所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑 乙烟酸。 优选地，所述生根培养基中，含有0.05-10μmol/L双草醚、25-1000μg/L灭草烟或 25-1000μg/L咪唑乙烟酸。 所述生根培养基中，优选含有0.05-5μmol/L双草醚，更优选地，含有0.1μmol/L双 草醚可获得良好的生根效率；或优选含有50-100μg/L灭草烟，更优选地，含有50μg/L灭草烟 可获得良好的生根效率；或优选含有50-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有50μg/L咪唑乙 烟酸可获得良好的生根效率，同时有效抑制非转基因分化苗生根。 以水稻为例，其他植物转基因方法可参考水稻： 1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组 7 CN 111593031 A 说 明 书 5/18 页 织，27℃暗培养30-50天； 2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于携带所述植物遗传转化筛 选载体的农杆菌的悬浮液(将携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌悬浮于悬浮培养基 中)中进行侵染，室温静置30分钟，之后晾干待用； 3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，22℃暗培养3天，至愈伤组织表面 出现菌体； 4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸 的筛选培养基中，27℃暗培养30-50天，进行抗性筛选； 5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的分化 培养基上，27℃光照培养25-40天至分化出幼苗； 6)生根：将幼苗接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的生根培养基上生根，30 ℃光照培养10-20天，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株种植； 以上所涉培养基的具体配方如下： 诱导培养基为N6D培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)浓度为3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/ L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L，pH值为5.9的培养基； 悬浮培养基为N6-AA培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙 酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0 .6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3- 0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM，pH值为 5.4的培养基； 共培养基为N6-AS培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/ L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM、琼脂粉 (Agar)浓度为7g/L，pH值为5.6的培养基； 筛选培养基为N6S培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.6-1g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.5-1.5g/ L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L、头孢(Cn)浓度为500mg/L。筛选培养 基中筛选剂双草醚浓度为0.25-1μmol/L，或灭草烟浓度为200-1000μg/L，或咪唑乙烟酸浓 度为300-1000μg/L，pH值为5.8的培养基； 分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素(KT)浓度 为1-2mg/L、α-萘乙酸(NAA)浓度为0.5-2mg/L、山梨醇浓度为20-40g/L、蔗糖浓度为30g/L、 植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。分化培养基中筛选剂双草醚浓度为0.05-1μmol/L、或灭 草烟浓度为25-1000μg/L或咪唑乙烟酸浓度为25-1000μg/L，pH值为5.9的培养基； 生根培养基为1/2MSR培养基，其为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为 20g/L、多效唑浓度为0.5-1mg/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。生根培养基中筛选剂双 草醚浓度为0.05-10μmol/L、灭草烟浓度为25-1000μg/L或咪唑乙烟酸浓度为25-1000μg/L， pH值为5.8的培养基； 本发明的有益效果至少包括：本发明提供水稻ALS突变蛋白，该突变蛋白可使得植 物高抗ALS抑制剂类除草剂。本发明还提供利用水稻ALS突变基因作为筛选标记的植物转基 8 CN 111593031 A 说 明 书 6/18 页 因筛选表达盒、植物遗传转化筛选载体以及相应的基因转化筛选方法。本发明的植物遗传 转化筛选载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用进行植物基因转化。本发明的 筛选标记为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了 植物转基因筛选方法，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众 对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良 好。 附图说明 图1为本发明实施例1中pCALSm3载体经XhoI酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK为 未酶切的pCALSm3重组质粒，1-4为酶切的pCALSm3重组质粒，可切出大小约为1.7kb片段。 图2为本发明实施例2中转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，1为 阴性对照(水做模板)，2为pCALSm3重组质粒阳性对照，3-12为转pCALSm3重组质粒农杆菌单 克隆菌液样品。 图3为本发明实施例1中pC0310载体图谱。 图4为本发明实施例1中pCALSm3载体图谱。 图5为本发明实施例3中普通水稻苗期双草醚临界浓度测试比较图；其中，苗盆左 侧为9311，右侧为ZH11，其中，0代表未施用双草醚，10×代表300mg/L，20×为600mg/L。 图6为本发明实施例3中普通水稻苗期灭草烟临界浓度测试图；其中，0.2×代表 19.6mg/L，0.5×，1×，2×，5×分别为相应的倍数；苗盆所种苗均为ZH11。 图7为本发明实施例3中普通水稻苗期咪唑乙烟酸临界浓度测试；其中，5×代表 375mg/L，20×，50×，100×，300×分别为相应的倍数；苗盆所种苗均为ZH11。 图8为本发明实施例4中水稻愈伤对双草醚抗性临界浓度测试结果；其中，N6为愈 伤在不添加筛选压的培养上筛选40d结果，N6 分别为添加0.25、0.5、1及2μmol/L双草醚筛 选压。 图9为本发明实施例8中双草醚筛选培养基筛选愈伤组织40d结果。 图10为本发明实施例14、20和28中分化培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟 酸分化愈伤组织30d的结果；其中，1和2为添加双草醚(0.1μmol/L)的分化培养，3和4为添加 灭草烟(50μg/L)的分化培养，5和6为添加咪唑乙烟酸(50μg/L)的分化培养；其中，1、3、5为 非转基因愈伤进行分化，2、4、6为转基因阳性愈伤进行分化。 图11为本发明实施例37、47和55中生根培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟 酸生根15d的结果；其中，1和2为添加双草醚(0.1μmol/L)的生根培养，3和4为添加灭草烟 (50μg/L)的生根培养，5和6分为添加咪唑乙烟酸(50μg/L)的生根培养；其中，1、3、5为非转 基因分化苗进行生根，2、4、6为转基因阳性分化苗进行生根。 图12为本发明实施例63中转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，1为 H2O、2为ZH11非转基因植株基因组DNA，3为质粒阳性对照，4-23为筛选获得的转基因植株基 因组DNA。 图13为本发明实施例64中T0转基因株系除草剂抗性测试结果；其中，a-d：双草醚 筛选株系移栽后喷施90mg/m2双草醚结果；a-d分别为喷施前，喷施后7天、14天、21天，图中 箭头表示野生型对照ZH11，在喷施14天时已完全死亡；e和f：灭草烟筛选株系移栽后喷施3 9 CN 111593031 A 说 明 书 7/18 页 ×(294mg/L)灭草烟，e：喷施前，f：喷施21天后；g-h：咪唑乙烟酸筛选株系后，喷施20× (1500mg/L)咪唑乙烟酸，g：喷施前，h：喷施21天后；其中，ZH11为野生型对照，9311和MH63均 为普通栽培稻对照，2-1、2-2、33-2、41和49-1均为转基因株系。
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体pCALSm3及其应用。本发明的水稻ALS突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的植物遗传转化筛选载体利用水稻ALS突变基因的表达盒作为筛选标记，在愈伤组织筛选阶段使用嘧啶 全部
背景技术：
随着基因工程和分子生物学技术的迅速发展，转基因技术的应用范围越来越广 泛。转基因技术具有诸多的优点，如可拓宽可利用的基因资源，创造新种质资源；可对植物 性状进行定向定点变异和选择；为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径等。转基因作 物于1996年被批准商业化种植，截至2017年，全球累计批准23种转基因作物进行商业化生 产，涉及包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等在内的超过16类目标性状。据统 计，2017年全球26个国家和地区种植以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转 基因作物，面积达1.9亿公顷。转基因作物的大面积推广，为全球农业生产做出了巨大贡献。 目前，随着转基因产品的不断推广，人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但 对转基因产品的争议仍甚嚣尘上，转基因产品潜在的安全风险问题仍受到普遍关切，因此， 转基因产品需要严格的控制和监管。对于转基因作物的争议关键之一是筛选标记可能带来 的潜在风险，其转入植物后对靶标生物的抗性、所表达蛋白质的致敏性以及对受体作物本 身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响是未知的。目前使用最多的是抗生 素类和除草剂类筛选标记，如潮霉素-HPT筛选系统、卡纳霉素-NPTII筛选系统、草丁膦-Bar 筛选系统等。这些筛选标记绝大多数为细菌等来源的外源基因，这也是引起公众担忧的原 因之一。如果能用植物内源的基因作为筛选标记重新转化植物则可去除外源基因引起的风 险和担忧。 乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2.1.6)是催化植物体内支链 氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)合成起始步骤的关键酶(Herrera-Estrella L,Block M D,M essens E,et al.Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells.The EM BO Journal,1983,2(6):987-995.)，是植物特有酶，动物中没有该酶，故可 通过抑制ALS酶阻断支链氨基酸的生物合成，进而达到清除植物杂草的目的，而且对人畜无 害。目前，已针对该酶研发和应用多种除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰 胺类除草剂等。ALS氨基酸序列中某个位点的突变，可使得ALS蛋白结构发生改变，导致ALS 抑制剂无法结合ALS，使得ALS对除草剂的敏感性降低，从而对相关除草剂产生抗性(Tan S, Evans RR ,Dahm er M L ,et al .Imidazolinone-tolerant crops：history ,current status and future .Pest Management Science ,2005 ,61(3)：246-257；Duggleby RG , McCourt JA ,Guddat LW .Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase.Plant Physiology and Biochemistry,2008,46(3)：309- 324；Lee H ,Rustgi S,Kumar N ,et al .Single nucleotide mutation in the barley acetohydroxy acid synthase(AH AS)gene confers resistance to imidazolinone 4 CN 111593031 A 说 明 书 2/18 页 herbicides .Proceedings of the National Academy of Sciences ,2011 ,108(21)： 8909.)。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供水稻ALS突变蛋白及其编码基因；本发明的另一目的 是为解决目前基因遗传转化中因使用外源筛选标记而导致的潜在安全风险的问题，提供一 种利用植物内源基因作为筛选标记应用于植物遗传转化筛选的载体。 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 第一方面，本发明提供水稻ALS突变蛋白，所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白 在95、96、171、548和627位具有氨基酸突变。上述氨基酸位点的组合突变可显著提高ALS蛋 白对于ALS抑制剂类除草剂的抗性，进而赋予植物对多种ALS抑制剂类除草剂的高抗性。 本发明所述的ALS突变蛋白中，95、96、171、548和627位氨基酸突变可为将所述植 物的野生型ALS蛋白的95、96、171、548和627位氨基酸突变为丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和苏氨酸中的任意一种。 更优选地，所述ALS突变蛋白相对于野生型在95位由Gly突变为Ala，在96位由Ala 突变为Thr，在171位由Pro突变为Arg，在548位由Trp突变为Leu，在627位由Ser突变为Ile。 优选地，所述ALS突变蛋白具有如下(1)或(2)的氨基酸序列： (1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列； (2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得 到的能够使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性的ALS突变蛋白的氨基酸序列。 本发明提供的水稻ALS突变蛋白对于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰 胺类除草剂均具有较高的抗性。 本发明提供编码所述ALS突变蛋白的核酸。所有能够编码所述ALS突变蛋白的核酸 序列均在本发明的保护范围内，例如：如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。 本发明提供包含编码所述ALS突变蛋白的核酸的生物材料，具体可为包含编码所 述ALS突变蛋白的核酸的表达盒、载体、宿主细胞或转基因植物细胞系。 本发明提供所述ALS突变蛋白或编码所述ALS突变蛋白的核酸或含有所述核酸的 生物材料的如下任一应用： (1)在使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性或提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性 中的应用； (2)在制备转基因植物中的应用； (3)在植物种质资源改良中的应用； (4)在作为植物遗传转化的筛选标记或构建植物遗传转化筛选载体中的应用。 本发明所述ALS抑制剂类除草剂包括但不限于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲 类或磺酰胺类除草剂。 本发明所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生、芝麻、棉花、亚 麻子、茵宿、燕麦、油菜籽、大麦、黑麦、小米、烟草、青稞、拟南芥等。优选地，所述植物为水 稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生或小米。 5 CN 111593031 A 说 明 书 3/18 页 第二方面，本发明提供一种植物转基因筛选表达盒，其以植物内源基因作为筛选 标记，所述植物内源基因为ALS突变基因。 优选地，所述ALS突变基因为水稻ALS突变基因。 更优选地，所述水稻ALS突变基因(ALSm3)的的编码蛋白为本发明所述的ALS突变 蛋白。 本发明发现，序列如SEQ ID NO.1所示的ALS突变蛋白更适于作为筛选标记，在植 物基因转化过程中能够更高效地发挥筛选标记的功能。 所述水稻ALS突变基因(ALSm3)的核苷酸序列可为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序 列。 所述植物转基因筛选表达盒还包含用于启动和终止所述ALS突变基因转录的启动 子和终止子。 所述启动子可为植物组成型启动子或植物组织特异性启动子。 其中，所述植物组成型启动子可为水稻ALS基因启动子，水稻或玉米的Ubi启动子 或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子可为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。 优选地，所述启动子为水稻ALS基因启动子。 所述终止子可为在植物中可以终止基因转录的DNA序列，包括水稻ALS基因终止 子、Ubi终止子等。 优选地，所述终止子为水稻Ubi终止子。 本发明发现，采用水稻ALS基因启动子和Ubi终止子配合调控水稻ALS突变基因的 转录，能够更好地控制ALS突变基因的高效、稳定、适度表达，使得ALS基因突变体更好地发 挥筛选标记的功能。 作为本发明的优选方案，所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 本发明提供所述ALS突变基因在作为植物遗传转化的筛选标记中的应用。 基于上述植物转基因筛选表达盒，本发明进一步提供一种植物遗传转化筛选载 体，该载体含有上述的植物转基因筛选表达盒。 优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体，可通过克隆其他 表达盒进入该载体进行遗传转化；所述其他表达盒是指除上述的植物转基因筛选表达盒外 的表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达 盒等。 更优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体还包括一系列多克隆位点如AfeI、 AvrII、PmlI、SnaBI、AloI、PmeI等，以便后续克隆目的基因进入。 作为本发明的优选方案，本发明提供的植物遗传转化筛选载体为pCALSm3，其核苷 酸序列如SEQ ID NO.4所示。 上述植物遗传转化筛选载体可通过以下方法制备得到： (1)构建植物转基因筛选表达盒：将序列如SEQ ID NO.2所示的ALS突变基因置于 该基因自身启动子ALSpro驱动下表达，在其下游以水稻Ubi终止子终止表达，得到序列如 SEQ ID NO.3所示的植物转基因筛选表达盒； (2)将植物转基因筛选表达盒连入植物双元表达载体pC0310，获得植物遗传转化 6 CN 111593031 A 说 明 书 4/18 页 筛选载体。 本发明还提供所述水稻ALS突变蛋白或所述转基因筛选表达盒在作为植物遗传转 化筛选标记中的应用。 本发明还提供所述水稻ALS突变蛋白、所述转基因筛选表达盒或所述植物遗传转 化筛选载体在植物遗传中的应用。 所述的应用具体为：将植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物 愈伤组织后，在筛选阶段将愈伤组织接种到添加除草剂的筛选培养基中，进行抗性筛选。 所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑 乙烟酸。 优选地，所述筛选培养基中，含有0.25～1μmol/L双草醚、200～1000μg/L灭草烟或 300～1000μg/L咪唑乙烟酸。 所述筛选培养基中，优选含有0.3-0.4μmol/L双草醚，更优选地，含有0.4μmol/L双 草醚可获得良好的筛选效率；或优选含有200-500μg/L灭草烟，更优选地，含有250-300μg/L 灭草烟可获得良好的筛选效率；或优选含有300-500μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有400- 500μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的筛选效率。 进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载 体转入植物愈伤组织后的分化阶段，将从筛选培养基中得到的阳性愈伤采用含有除草剂的 分化培养基进行分化培养。 所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑 乙烟酸。 优选地，所述分化培养基中，含有0.05-1μmol/L双草醚、25-1000μg/L灭草烟或25- 1000μg/L咪唑乙烟酸。 所述分化培养基中，优选含有0.05-0.25μmol/L双草醚，更优选地，含有0.1μmol/L 双草醚可获得良好的分化效率；或优选含有30-100μg/L灭草烟，更优选地，含有50μg/L灭草 烟可获得良好的分化效率；或优选含有30-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有50μg/L咪唑 乙烟酸可获得良好的分化效率，同时有效抑制非转基因愈伤分化成苗。 进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载 体转入植物愈伤组织后的生根阶段，将分化培养得到的阳性苗采用含除草剂的生根培养基 进行生根培养。 所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑 乙烟酸。 优选地，所述生根培养基中，含有0.05-10μmol/L双草醚、25-1000μg/L灭草烟或 25-1000μg/L咪唑乙烟酸。 所述生根培养基中，优选含有0.05-5μmol/L双草醚，更优选地，含有0.1μmol/L双 草醚可获得良好的生根效率；或优选含有50-100μg/L灭草烟，更优选地，含有50μg/L灭草烟 可获得良好的生根效率；或优选含有50-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有50μg/L咪唑乙 烟酸可获得良好的生根效率，同时有效抑制非转基因分化苗生根。 以水稻为例，其他植物转基因方法可参考水稻： 1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组 7 CN 111593031 A 说 明 书 5/18 页 织，27℃暗培养30-50天； 2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于携带所述植物遗传转化筛 选载体的农杆菌的悬浮液(将携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌悬浮于悬浮培养基 中)中进行侵染，室温静置30分钟，之后晾干待用； 3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，22℃暗培养3天，至愈伤组织表面 出现菌体； 4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸 的筛选培养基中，27℃暗培养30-50天，进行抗性筛选； 5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的分化 培养基上，27℃光照培养25-40天至分化出幼苗； 6)生根：将幼苗接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的生根培养基上生根，30 ℃光照培养10-20天，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株种植； 以上所涉培养基的具体配方如下： 诱导培养基为N6D培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)浓度为3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/ L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L，pH值为5.9的培养基； 悬浮培养基为N6-AA培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙 酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0 .6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3- 0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM，pH值为 5.4的培养基； 共培养基为N6-AS培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/ L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM、琼脂粉 (Agar)浓度为7g/L，pH值为5.6的培养基； 筛选培养基为N6S培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.6-1g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.5-1.5g/ L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L、头孢(Cn)浓度为500mg/L。筛选培养 基中筛选剂双草醚浓度为0.25-1μmol/L，或灭草烟浓度为200-1000μg/L，或咪唑乙烟酸浓 度为300-1000μg/L，pH值为5.8的培养基； 分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素(KT)浓度 为1-2mg/L、α-萘乙酸(NAA)浓度为0.5-2mg/L、山梨醇浓度为20-40g/L、蔗糖浓度为30g/L、 植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。分化培养基中筛选剂双草醚浓度为0.05-1μmol/L、或灭 草烟浓度为25-1000μg/L或咪唑乙烟酸浓度为25-1000μg/L，pH值为5.9的培养基； 生根培养基为1/2MSR培养基，其为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为 20g/L、多效唑浓度为0.5-1mg/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。生根培养基中筛选剂双 草醚浓度为0.05-10μmol/L、灭草烟浓度为25-1000μg/L或咪唑乙烟酸浓度为25-1000μg/L， pH值为5.8的培养基； 本发明的有益效果至少包括：本发明提供水稻ALS突变蛋白，该突变蛋白可使得植 物高抗ALS抑制剂类除草剂。本发明还提供利用水稻ALS突变基因作为筛选标记的植物转基 8 CN 111593031 A 说 明 书 6/18 页 因筛选表达盒、植物遗传转化筛选载体以及相应的基因转化筛选方法。本发明的植物遗传 转化筛选载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用进行植物基因转化。本发明的 筛选标记为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了 植物转基因筛选方法，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众 对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良 好。 附图说明 图1为本发明实施例1中pCALSm3载体经XhoI酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK为 未酶切的pCALSm3重组质粒，1-4为酶切的pCALSm3重组质粒，可切出大小约为1.7kb片段。 图2为本发明实施例2中转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，1为 阴性对照(水做模板)，2为pCALSm3重组质粒阳性对照，3-12为转pCALSm3重组质粒农杆菌单 克隆菌液样品。 图3为本发明实施例1中pC0310载体图谱。 图4为本发明实施例1中pCALSm3载体图谱。 图5为本发明实施例3中普通水稻苗期双草醚临界浓度测试比较图；其中，苗盆左 侧为9311，右侧为ZH11，其中，0代表未施用双草醚，10×代表300mg/L，20×为600mg/L。 图6为本发明实施例3中普通水稻苗期灭草烟临界浓度测试图；其中，0.2×代表 19.6mg/L，0.5×，1×，2×，5×分别为相应的倍数；苗盆所种苗均为ZH11。 图7为本发明实施例3中普通水稻苗期咪唑乙烟酸临界浓度测试；其中，5×代表 375mg/L，20×，50×，100×，300×分别为相应的倍数；苗盆所种苗均为ZH11。 图8为本发明实施例4中水稻愈伤对双草醚抗性临界浓度测试结果；其中，N6为愈 伤在不添加筛选压的培养上筛选40d结果，N6 分别为添加0.25、0.5、1及2μmol/L双草醚筛 选压。 图9为本发明实施例8中双草醚筛选培养基筛选愈伤组织40d结果。 图10为本发明实施例14、20和28中分化培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟 酸分化愈伤组织30d的结果；其中，1和2为添加双草醚(0.1μmol/L)的分化培养，3和4为添加 灭草烟(50μg/L)的分化培养，5和6为添加咪唑乙烟酸(50μg/L)的分化培养；其中，1、3、5为 非转基因愈伤进行分化，2、4、6为转基因阳性愈伤进行分化。 图11为本发明实施例37、47和55中生根培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟 酸生根15d的结果；其中，1和2为添加双草醚(0.1μmol/L)的生根培养，3和4为添加灭草烟 (50μg/L)的生根培养，5和6分为添加咪唑乙烟酸(50μg/L)的生根培养；其中，1、3、5为非转 基因分化苗进行生根，2、4、6为转基因阳性分化苗进行生根。 图12为本发明实施例63中转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，1为 H2O、2为ZH11非转基因植株基因组DNA，3为质粒阳性对照，4-23为筛选获得的转基因植株基 因组DNA。 图13为本发明实施例64中T0转基因株系除草剂抗性测试结果；其中，a-d：双草醚 筛选株系移栽后喷施90mg/m2双草醚结果；a-d分别为喷施前，喷施后7天、14天、21天，图中 箭头表示野生型对照ZH11，在喷施14天时已完全死亡；e和f：灭草烟筛选株系移栽后喷施3 9 CN 111593031 A 说 明 书 7/18 页 ×(294mg/L)灭草烟，e：喷施前，f：喷施21天后；g-h：咪唑乙烟酸筛选株系后，喷施20× (1500mg/L)咪唑乙烟酸，g：喷施前，h：喷施21天后；其中，ZH11为野生型对照，9311和MH63均 为普通栽培稻对照，2-1、2-2、33-2、41和49-1均为转基因株系。
