技术摘要：
本发明提供一种基于数字PCR的HPV E6E7 mRNA检测试剂盒及使用其的检测方法，所述检测试剂盒包括如下组分：RNA抽提试剂、cDNA逆转录体系、数字PCR检测体系。其中，所述RNA抽提试剂包括如下组分：裂解液、去蛋白液、漂洗液、无RNA酶双蒸水、RNase‑Free吸附柱CR3。所述cDN  全部
背景技术：
传统PCR由于是大体积反应系统，非特异性的扩增增加了假阳性结果和背景信号， 因此，最终无法获得绝对定量的结果。数字PCR  (dPCR)是近年来引起重视并迅速发展起来 的一种突破性的核酸定量分析技术。该技术先将核酸模板进行稀释，分配到大量独立的反 应单元中，使每个反应单元中只有单个模板分子，然后进行PCR扩增反应，扩增结束后对每 个反应室的荧光信号进行统计学分析，来定量  DNA拷贝数。数字PCR采用先扩增后定量，因 此不依赖扩增曲线的循环阈值(Ct)，也无需采用内参基因和标准曲线，准确度高、重现性 好，可以实现绝对定量分析。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种基于数字PCR的HPV E6E7  mRNA检测试剂盒 及使用其的检测方法，采用数字PCR技术极大减少了扩增后的背景荧光，显著提升检测通 量,提升检测浓度下限，极大提高检测精确性可以做到绝对定量。 为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种基于数字PCR 的HPV  E6E7  mRNA 检测试剂盒，包括如下组分：RNA抽提试剂、  cDNA逆转录体系、数字PCR检测体系。 其中，所述RNA抽提试剂包括如下组分：裂解液、去蛋白液、漂洗液、无RNA酶双蒸 水、RNase-Free吸附柱CR3； 所述裂解液的组成浓度为：50mmol/L  Tris-HCl、1.0mmol/L  EDTA、  150mmol/L  NaCl、0.1％SDS； 所述去蛋白液的组成浓度为：75％乙醇、10％tris  edta、5％异丙醇、10％SDS； 所述漂洗液选用70％乙醇。 其中，所述cDNA逆转录体系包括如下组分：10×RT  Mix、Super pure  dNTPs(2.5mM  each)、oligo-dT、Quant  Reverse  Transcriptase、  RNase-Free水。 其中，所述数字PCR检测体系按体积百分比包括如下组分： 4 CN 111575402 A 说　明　书 2/9 页 优选的，所述正向引物的工作浓度为20uM，终浓度为0.5uM；所述反向引物的工作 浓度为20uM，终浓度为0.5uM；所述HPV检测探针的工作浓度为10uM，终浓度为0.2uM；所述 Genotyping Mastermix的终浓度为1uM；所述Droplet  Stabilizer的工作浓度为  25uM，终 浓度为1uM。 其中，所述数字PCR检测体系的pH范围为8.2-8.6。 所述数字PCR检测体系为HPV不同亚型基因标准品，具体如下表所示： 5 CN 111575402 A 说　明　书 3/9 页 本发明还提供一种使用上述的基于数字PCR的HPV  E6E7  mRNA检测试剂盒的检测 方法，包括如下步骤： 6 CN 111575402 A 说　明　书 4/9 页 (1)标本RNA抽提制备 (1-1)将裂解液、去蛋白液混合均匀，匀浆样品在15-30℃，放置5min，使得核酸蛋 白复合物完全分离； (1-2)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15sec，室温放置  3min； (1-3)4℃、12000rpm(～13400×g)离心10min，样品分成三层：黄色的有机相、中间 层和无色的水相，RNA在水相中，水相的体积约为所用裂解液试剂的50％，把水相转移到新 管中； (1-4)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到溶液和 沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR3中，4℃、  12000rpm(～13400×g)离心30sec，若一次不 能将全部溶液和混合物加入RNase-Free吸附柱CR3中，分多次转入RNase-Free吸附柱CR3  中，4℃、12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃掉收集管中的废液； (1-5)向RNase-Free吸附柱CR3中加入500μl漂洗液，4℃、  12000rpm(～13400×g) 离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中； (1-6)将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1 .5ml离心管中，加入30-100μl  RNase-Free  ddH2O，室温放置2min，4℃、12000rpm  (～13400×g)离心30sec，收集洗脱液 体； (2)逆转录cDNA (2-1)将模板RNA在冰上解冻；引物、10×RT  mix解冻，解冻后迅速置于冰上，使用 前将每种溶液涡旋震荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体； (2-2)按照下表的逆转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5min， 离心后置于冰上； ； (2-3)37℃孵育60min； (3)阳性质控品和阴性对照品处理 阴性对照品和阳性质控品充分混匀，10000rpm离心后使用去离子水将阴性对照品 和阳性质控品分别稀释10倍，充分混匀，10000rpm  离心后备用待测； (4)将配制好的反应体系充分混匀，按32μl/管分装至1.5ml  灭菌尖底离心管内， 备用； (5)加样：在步骤(4)中准备的装有混合反应液的1.5ml灭菌尖底离心管内，分别加 入抽提后的标本模板8μl，或直接加入待测阴性对照品和阳性质控品各2μl(用去离子不足 体积至40μl)，充分混匀，10000rpm离心后将1.5ml灭菌尖底离心管内混有模板的体系依次 7 CN 111575402 A 说　明　书 5/9 页 转移至source芯片的孔中； (6)液滴生成：利用 数字PCR液滴生成系统使反应体系在单个反应管 内生成八百万个油包水液滴； (7)PCR扩增 循环程序设置如下：50℃2min，95℃10min； 95℃15s→60℃1min，共45个循环； 98℃10min，1个循环； 最终冷却至12℃； 保存文件，运行； 在ABI热循环仪设定PCR循环第二步温度变化截率为0.5℃/min，其他为默认值； (8)反应完毕，存储结果以便进行数据处理； (9)液滴荧光信号读取； (10)结果判断：反应结束后自动保存检测数据文件，使用  RainDrop  Analyst  software  II对结果进行分析，选择之前质粒结果作为模板进行设门，后对VIC和FAM通道同 时进行荧光补偿排除杂信号干扰。 本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明采用数字PCR  技术极大减少了扩 增后的背景荧光，显著提升检测通量,提升检测浓度下限，极大提高检测精确性可以做到绝 对定量。 附图说明 图1为本发明实施例一的检测结果图； 图2为本发明实施例二的检测结果图。