技术摘要：
本专利公开了一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，涉及生物传感领域。通过设计结构可切换的哑铃型探针，提高了目标识别的特异性，同时又使得滚环扩增产物具有串联重复茎环结构的特点；滚环扩增产物与修饰DNA‑AuNPs杂交形成DNA网状结构，使得AuNPs发生聚集，利用  全部
背景技术：
MicroRNA（miRNA）目前是一个十分活跃的研究领域，它对于深入探讨生命现象的 本质、解释细胞行为和疾病发生机制、以及疾病诊断、基因治疗药物的开发都具有重大意 义。miRNA广泛存在于各种动、植物中，参与多种重要的生命活动。它作为基因调控的重要调 控因子，在许多生物学过程中发挥着重要作用，但它的调控范围并不仅限于正常的生理活 动，还与许多肿瘤、癌症的发生有着密切的联系。 MiRNA被视为一种新型的生物标志物和各种疾病的潜在治疗靶标。它的广泛存在 与进化上的保守性，暗示它在生命活动中具有必不可少的调节作用，他们参与动植物生长 发育、细胞分化、细胞增殖与调亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。MiRNA无论在数量上还 是功能上，可能都远远超过目前的发现，因此miRNA的检测成为当前研究的热点和前沿。然 而，由于miRNA固有的易降解和低丰度的特点，使得难以高灵敏的检测miRNA。 为了解决miRNA在低浓度下也能被检测的问题，miRNA的识别和信号放大检测策略 变得尤为重要。然而，目前常见的miRNA检测方法，例如荧光比色法、荧光法、化学发光法等 光学检测方法灵敏度不高且易受光稳定性和复杂生物样品的影响。因此发展一种既稳定又 能高灵敏的检测miRNA的方法具有重要意义。本实验试图开发一种灵敏稳定的方法，设计结 构可切换的哑铃型探针，利用滚环扩增技术构建DNA网状结构，利用稳定的动态光散射技术 实现miRNA的高灵敏检测。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是通过滚环扩增技术构建DNA网状结构实现miRNA的高 灵敏检测。 一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤： （1）探针设计 根据目标链序列设计相应的挂锁探针PP、修饰金纳米粒子（AuNPs）的DNA序列；其中，哑 铃型挂锁探针PP序列的5端修饰了磷酸基团，修饰AuNPs的DNA序列的3端修饰了巯基（C6- SH）； （2）哑铃型挂锁探针PP的连接 哑铃型挂锁探针PP的连接反应在10 μL溶液体积中进行，其中包10 μM挂锁探针PP，2 μ L  10×T4  DNA连接酶反应缓冲液，1 μM目标miRNA，20  U/μL  T4  DNA连接酶和5 μL的DEPC处 理水，加入T4  DNA连接酶之前，将反应混合物在55°C下加热5分钟，然后在39°C退火30分钟， 冷却至室温，然后加入T4  DNA连接酶，在16°C下进行连接反应2小时； 3 CN 111575353 A 说　明　书 2/2 页 （3）滚环扩增反应 向（2）步骤中得到的溶液中加入2.5 μL  10×phi29  DNA聚合酶反应缓冲液，0.5 μL  BSA，3 μL浓度为25  mM的dNTPs，1 μL的phi29  DNA聚合酶和8 μL的DEPC处理水；所得混合物 在30°C下反应6小时，然后在65°C下孵育10分钟终止反应； （4）动态光散射技术检测 向（3）步骤中得到的溶液中加入10 μL  DNA-AuNPs，将混合液在37°C孵化30分钟；然后 进行动态光散射测量，实验参数如下：25  °C，平衡稳定时间10秒和测量角度90°。 本发明的有益效果 （1）探针的哑铃型结构使得滚环扩增产物具有串联重复茎环序列，与DNA-AuNPs杂交形 成DNA网状结构，使得AuNPs发生聚集，尺寸变大； （2）利用结构可切换的哑铃型探针特异性识别miRNA，启动滚环扩增反应，实现信号的 放大； （3）本发明所述方法灵敏度高、特异性好。 附图说明 图一为本文所述方法的实验原理图。