技术摘要：
本发明公开了一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括，称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，得碱提滤液，pH值调至6.8～7.0，再加入胃蛋白酶，50～60℃条件下反应2～3h，制得粗酶解液，将灭活的酶解液pH值调至6.4～6.6，加入活性炭，搅拌吸附1～2 全部
背景技术：
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，简称CS)，是一种聚阴离子酸性粘多糖，属糖 胺聚糖类物质，由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结成双糖聚合物，一般呈白色或微黄色的 粉末，略带碱味，无臭，无味，具有吸湿性，易溶于水，难溶于甲醇，乙醇，乙醚，丙酮和冰醋酸 等有机溶剂，并且遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落，在酸性条件下更易水解成不同聚合 度的低聚糖。硫酸软骨素广泛存在于人和动物的骨骼、软骨、肌腱、韧带等组织中，发挥着许 多重要的生理功能。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性，目前临 床上主要用于骨关节炎、心脑血管疾病及眼科疾病的预防和治疗，且长期服用毒副作用小， 是很有开发潜力的药物。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异 味。在化妆品中添加硫酸软骨素，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水 分和改善发质。 随着硫酸软骨素生物活性不断被揭示和其应用领域的不断扩展,有关硫酸软骨素 的提取、纯化和分离技术已取得了一定的研究成果。目前硫酸软骨素的分离方法主要有碱 法提取、盐法提取、酶法提取、超声辅助法等，但这些方法存在步骤繁琐，操作困难，生产周 期长，成本高，产品纯度和得率都偏低，质量不稳定的问题。
技术实现要素：
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部 分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。 鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。 因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸 软骨素的方法。 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸 软骨素的方法，包括，称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，并间歇搅 拌，过滤，收集滤液，取滤渣用同样的方法处理一次，过滤，合并两次滤液，得碱提滤液；将碱 提滤液pH值调至6.8～7.0，再加入占碱提滤液质量百分比为1～1.2％的胃蛋白酶，50～60 ℃条件下反应2～3h，制得粗酶解液，灭酶处理得酶解液；将灭活的酶解液pH值调至6.4～ 6.6，加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，弃滤渣，得吸附滤液；向吸附滤液中加入占 吸附滤液质量百分比为10％的蛋白沉淀剂，搅拌、离心，弃沉淀，得鱼骨浸提液；取鱼骨浸提 液，加入占鱼骨浸提液质量百分数4％-4.5％的无水乙酸钠，搅拌，用NaOH溶液调节pH至5.8 ～6.2，加入乙醇，搅拌，4℃静置12h，离心后弃上清液，取沉淀在60～70℃条件下干燥，得硫 3 CN 111548433 A 说 明 书 2/8 页 酸软骨素。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述鮰鱼鱼骨粉，其制备方法为：将鮰鱼鱼骨于80～100℃水中煮1h，除去残留的肌肉、脂肪和 其它结缔组织，80℃烘干3.5h，粉碎至60目，采用3倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h，回收丙 酮后，再加入2倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干，即得鱼骨粉。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，其中，所述NaOH溶液的浓度为 1mol/L，NaOH溶液与鮰鱼鱼骨粉体积质量比以mL：g计为6:1。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述间歇搅拌，搅拌速率为每隔10min搅拌一次，搅拌转速为60r/min，每次搅拌时间为1min。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述胃蛋白酶，其酶活为474U/mg。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述灭酶处理得酶解液，其中，灭酶处理温度为90℃，灭酶处理时间为10min，用冷水迅速降至 室温。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，其中，活性炭的加入量为清液体积的5～6％， 搅拌转速为60～80r/min，静置时间为0.5～1h。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述向吸附滤液中加入占吸附滤液质量10％的蛋白沉淀剂，搅拌、离心，其中，蛋白沉淀剂为 三氯乙酸，搅拌转速为60～80r/min，时间为1～2min，离心转速为5000r/min，离心时间为 20min。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述加入乙醇，搅拌，其中，乙醇浓度为80～90Wt％的乙醇，搅拌转速为40～60r/min，时间为1 ～3min。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述离心后弃上清液，取沉淀在60～70℃条件下干燥，其中，离心转速为5000r/min，离心时间 为20min，干燥方法为真空干燥或冷冻干燥中的一种。 本发明有益效果： (1)本发明提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，通过“稀碱-酶”法提取 硫酸软骨素，用蛋白酶将蛋白聚糖和胶原蛋白等水解成短肽或氨基酸，酶法反应条件温和， 但硫酸软骨素结构不易被破坏，蛋白酶无法使糖昔键及其周围的化链彻底断裂，将影响产 品纯度，因此，本发明采用稀碱法先除去长肽链，再结合酶法进行提取，可有效提高生产效 率，同时又能减少碱液使用量，降低生产成本。 (2)本发明从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，以鮰鱼鱼骨粉为原料，通过稀碱处理 后，优选胃蛋白酶作为水解酶，并优选酶解参数，结合后续的活性炭吸附工艺、蛋白沉淀工 艺和特定的醇沉工艺，各工艺协同作用，硫酸软骨素的纯度和得率均达到最佳。同时，本发 明意外发现，采用胃蛋白酶更有利于鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，提取效果更佳，可能由于 胃蛋白酶在对蛋白或多肽进行剪切时，具有一定的氨基酸序列特异性，倾向于剪切氨基端 4 CN 111548433 A 说 明 书 3/8 页 或羧基端为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽键，而鮰鱼鱼骨中 与硫酸软骨素相结合的蛋白质中氨基端或羧基端为芳香族氨基酸的蛋白质较多，所以胃蛋 白酶的提取效果更佳。 (3)本发明首次以鮰鱼鱼骨为原料提取硫酸软骨素，高值化利用加工下脚料，既节 约了资源、保护了环境，又开阔了硫酸软骨素的来源，同时提高鮰鱼的利用率，本发明的提 取方法工艺生产操作方便，生产周期短，得率高。
本发明公开了一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，包括，称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，得碱提滤液，pH值调至6.8～7.0，再加入胃蛋白酶，50～60℃条件下反应2～3h，制得粗酶解液，将灭活的酶解液pH值调至6.4～6.6，加入活性炭，搅拌吸附1～2 全部
背景技术：
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，简称CS)，是一种聚阴离子酸性粘多糖，属糖 胺聚糖类物质，由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结成双糖聚合物，一般呈白色或微黄色的 粉末，略带碱味，无臭，无味，具有吸湿性，易溶于水，难溶于甲醇，乙醇，乙醚，丙酮和冰醋酸 等有机溶剂，并且遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落，在酸性条件下更易水解成不同聚合 度的低聚糖。硫酸软骨素广泛存在于人和动物的骨骼、软骨、肌腱、韧带等组织中，发挥着许 多重要的生理功能。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性，目前临 床上主要用于骨关节炎、心脑血管疾病及眼科疾病的预防和治疗，且长期服用毒副作用小， 是很有开发潜力的药物。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异 味。在化妆品中添加硫酸软骨素，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水 分和改善发质。 随着硫酸软骨素生物活性不断被揭示和其应用领域的不断扩展,有关硫酸软骨素 的提取、纯化和分离技术已取得了一定的研究成果。目前硫酸软骨素的分离方法主要有碱 法提取、盐法提取、酶法提取、超声辅助法等，但这些方法存在步骤繁琐，操作困难，生产周 期长，成本高，产品纯度和得率都偏低，质量不稳定的问题。
技术实现要素：
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部 分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。 鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。 因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸 软骨素的方法。 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸 软骨素的方法，包括，称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，并间歇搅 拌，过滤，收集滤液，取滤渣用同样的方法处理一次，过滤，合并两次滤液，得碱提滤液；将碱 提滤液pH值调至6.8～7.0，再加入占碱提滤液质量百分比为1～1.2％的胃蛋白酶，50～60 ℃条件下反应2～3h，制得粗酶解液，灭酶处理得酶解液；将灭活的酶解液pH值调至6.4～ 6.6，加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，弃滤渣，得吸附滤液；向吸附滤液中加入占 吸附滤液质量百分比为10％的蛋白沉淀剂，搅拌、离心，弃沉淀，得鱼骨浸提液；取鱼骨浸提 液，加入占鱼骨浸提液质量百分数4％-4.5％的无水乙酸钠，搅拌，用NaOH溶液调节pH至5.8 ～6.2，加入乙醇，搅拌，4℃静置12h，离心后弃上清液，取沉淀在60～70℃条件下干燥，得硫 3 CN 111548433 A 说 明 书 2/8 页 酸软骨素。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述鮰鱼鱼骨粉，其制备方法为：将鮰鱼鱼骨于80～100℃水中煮1h，除去残留的肌肉、脂肪和 其它结缔组织，80℃烘干3.5h，粉碎至60目，采用3倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h，回收丙 酮后，再加入2倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干，即得鱼骨粉。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述称取鮰鱼鱼骨粉，加入NaOH溶液于50℃水浴中恒温浸泡6h，其中，所述NaOH溶液的浓度为 1mol/L，NaOH溶液与鮰鱼鱼骨粉体积质量比以mL：g计为6:1。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述间歇搅拌，搅拌速率为每隔10min搅拌一次，搅拌转速为60r/min，每次搅拌时间为1min。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述胃蛋白酶，其酶活为474U/mg。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述灭酶处理得酶解液，其中，灭酶处理温度为90℃，灭酶处理时间为10min，用冷水迅速降至 室温。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述加入活性炭，搅拌吸附1～2h，静置后过滤，其中，活性炭的加入量为清液体积的5～6％， 搅拌转速为60～80r/min，静置时间为0.5～1h。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述向吸附滤液中加入占吸附滤液质量10％的蛋白沉淀剂，搅拌、离心，其中，蛋白沉淀剂为 三氯乙酸，搅拌转速为60～80r/min，时间为1～2min，离心转速为5000r/min，离心时间为 20min。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述加入乙醇，搅拌，其中，乙醇浓度为80～90Wt％的乙醇，搅拌转速为40～60r/min，时间为1 ～3min。 作为本发明所述从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法的一种优选方案，其中：所 述离心后弃上清液，取沉淀在60～70℃条件下干燥，其中，离心转速为5000r/min，离心时间 为20min，干燥方法为真空干燥或冷冻干燥中的一种。 本发明有益效果： (1)本发明提供一种从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，通过“稀碱-酶”法提取 硫酸软骨素，用蛋白酶将蛋白聚糖和胶原蛋白等水解成短肽或氨基酸，酶法反应条件温和， 但硫酸软骨素结构不易被破坏，蛋白酶无法使糖昔键及其周围的化链彻底断裂，将影响产 品纯度，因此，本发明采用稀碱法先除去长肽链，再结合酶法进行提取，可有效提高生产效 率，同时又能减少碱液使用量，降低生产成本。 (2)本发明从鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，以鮰鱼鱼骨粉为原料，通过稀碱处理 后，优选胃蛋白酶作为水解酶，并优选酶解参数，结合后续的活性炭吸附工艺、蛋白沉淀工 艺和特定的醇沉工艺，各工艺协同作用，硫酸软骨素的纯度和得率均达到最佳。同时，本发 明意外发现，采用胃蛋白酶更有利于鮰鱼鱼骨中提取硫酸软骨素，提取效果更佳，可能由于 胃蛋白酶在对蛋白或多肽进行剪切时，具有一定的氨基酸序列特异性，倾向于剪切氨基端 4 CN 111548433 A 说 明 书 3/8 页 或羧基端为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽键，而鮰鱼鱼骨中 与硫酸软骨素相结合的蛋白质中氨基端或羧基端为芳香族氨基酸的蛋白质较多，所以胃蛋 白酶的提取效果更佳。 (3)本发明首次以鮰鱼鱼骨为原料提取硫酸软骨素，高值化利用加工下脚料，既节 约了资源、保护了环境，又开阔了硫酸软骨素的来源，同时提高鮰鱼的利用率，本发明的提 取方法工艺生产操作方便，生产周期短，得率高。
