技术摘要：
本发明公开了一种HPD‑100大孔树脂对甘草地上部分总黄酮的纯化工艺。以甘草地上部分总黄酮为研究对象，通过静态动力学吸附研究其在HPD‑100大孔树脂上的吸附特性，结果表明，拟二级动力学模型（R2>0.99）能够较好地描述甘草地上部分总黄酮在HPD‑100树脂上的吸附过程。 全部
背景技术：
甘草地上部分富含黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、强心、镇静等作用，同时具有 明显的抗氧化、预防肿瘤等明显的药理作用。目前市场对甘草的需求量日益增加，然而，在 甘草的传统使用方法中只取用甘草根，而对地上部分未合理利用，同时对甘草纯化工艺并 不完善，因而不利于工业生产。大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的新型高分子 材料，具有物理化学稳定性高，比表面积大，吸附容量大，选择性好，吸附速度快，解吸条件 温和，再生处理方便，使用周期长，节省费用等多种优点，常用于中药材有效成分的分离纯 化。 文献（易运红等，大孔吸附树脂纯化甘草黄酮类化合物的研究，安徽农业科学，2016, 9 (05): 567-570）通过建立了HPLC-DAD高效液相指纹图谱很好地反映甘草地上部分脂溶性 黄酮类成分，具有良好的抗氧化能力。相关专利有：专利CN108261438A（刘忠英，一种甘草黄 酮组分的提取与纯化方法）中，以蒸馏水提取甘草有效成分，再经甲醇和乙酸乙酯处理对甘 草中黄酮组分粗分离，采用大孔树脂和聚酞胺树脂联合过柱法进行，该方法用水作为提取 溶剂，未能将黄酮类成分有效提取，并且整个方法周期太长、成本高。专利CN109303795A（许 云芳，一种甘草黄酮的提取方法）公开了一种甘草黄酮的提取方法，加入饱和醋酸铅水溶液 并通入硫化氢气体对甘草黄酮进行分离有效物质，该方法存在有机溶剂的残留和提取效率 低的问题。当前，采用大孔树脂分离纯化甘草地上部分总黄酮的文献和专利未见报道，本发 明通过对大孔树脂的筛选，并对其动力学进行研究，通过设计筛选成熟的工艺步骤和工艺 参数，以得到纯度高、生物活性好、质量稳定的甘草黄酮产品。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用绿色新型大孔吸附树脂纯 化甘草地上部分总黄酮的方法，通过设计筛选，并对吸附热力学及其动力学研究，得到成熟 的工艺步骤和工艺参数，以得到纯度高、生物活性好、质量稳定的甘草地上部分总黄酮产 品。 为实现上述目的，一种HPD-100大孔树脂对甘草地上部分总黄酮的纯化工艺步骤如下： 1.甘草地上部分粗提液的制备： 将甘草地上部分剪裁至小段，用粉碎机粉碎过80目筛，准确称取10-100 g甘草地上部 分粉末，加入10-20倍量乙醇溶液，在65-85℃条件下提取1-3 h，减压抽滤分离滤液和滤渣， 将滤渣重复提取1-3次，合并上清液，即得甘草地上部分粗提液。 2.甘草地上部分提取液总黄酮成分的纯化 2.1 大孔树脂预处理：大孔树脂用去离子水冲洗，除去白色漂浮物，吸水纸吸走树脂表 3 CN 111588745 A 说 明 书 2/4 页 面的水分，树脂用95%乙醇浸泡24-48 h。用去离子水淋洗树脂至无醇味，4% HCl溶液浸泡2- 5 h。用去离子水淋洗树脂至中性，4% NaOH溶液浸泡2 h，用去离子水淋洗树脂至中性，以滤 纸吸去树脂表面水分，备用。 2.2 大孔树脂的筛选：（1）准确秤取预处理好的4种大孔树脂4份于锥形瓶中，加入等量 的甘草地上部分粗提液置于恒温摇床反应5 h，定时取样。样品溶液定容，测定溶液吸光度， 计算得到不同大孔树脂对甘草黄酮的吸附率，同时绘制不同时刻不同树脂的静态吸附动力 学曲线（总黄酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定，绘制标准曲线，下同）。（2）取（1） 中吸附饱和的大孔树脂，分别加入浓度相同的醇溶液置于恒温摇床进行黄酮的解吸，5 h后 同法测定溶液吸光度，计算得到不同树脂的解吸率。 2.3 HPD-100大孔树脂吸附动力学模型回归线方程拟合：通过对2.2筛选得到HPD-100 型号树脂绘制静态吸附热力学曲线，通过拟一级动力学方程（1）和拟二级动力学方程（2）公 式得到吸附动力学模型拟合回归方程及其参数。预测HPD-100大孔树脂吸附动力学行为： 2.4 HPD-100大孔树脂的静态试验 （1）配制浓度为2.26 mg/ml甘草地上部分总黄酮粗提物溶液，再稀释为0.14-2.26 mg/ ml一系列浓度梯度的待测液，各加入一定量预处理的大孔树脂，恒温摇床反应，测定溶液吸 光度。 （2）取甘草地上部分总黄酮粗品溶解后定容，取50 mL溶液5份，调节至不同pH，再分别 加入一定量大孔树脂，恒温摇床反应，测定溶液吸光度 （3）取吸附饱和的树脂若干，均分为五份，分别加入50 mL不同浓度的乙醇进行解吸，测 定解吸溶液的吸光度。 2.5 HPD-100大孔吸附树脂的动态实验 （1）取一定量预处理HPD-100大孔树脂湿法装柱，树脂床柱体积为1 BV。使用SK-500Ⅲ 注射泵控制自动上样速度，每10 ml采集一次样品，测定吸光度（以上样溶液浓度的1/10为 泄露标准），绘制不同上样速度下的大孔树脂泄露曲线。 （2）将（1）吸附平衡的大孔树脂用去离子水洗涤，再用乙醇溶液洗脱，最后得到洗脱液， 每10 ml采集一次样品，绘制不同洗脱液流速与洗脱液体积对大孔树脂吸附效果的影响曲 线，最佳工艺验证，收集流出液浓缩至干，即得纯化后甘草地上部分总黄酮。 3.清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基活性测定：准确称取等量甘草地上部 分总黄酮粗提物和纯化物配置不同梯度浓度。称取15-50 mg DPPH试剂，以无水乙醇溶解至 1000 mL容量瓶，摇匀即得DPPH溶液，避光保存。分别取1 mL待测样液和3 mL DPPH溶液混合 摇匀，室温且避光反应30 min，于517 nm波长下测定吸光度值。以待测液溶剂为空白对照， 计算样品自由基清除率。同样方法制备L-抗坏血酸（Vc）对照品溶液。 附图说明： 图1为2.2甘草总黄酮含量测定标准曲线； 图2为2.2中不同树脂对黄酮的吸附率与解吸率的影响； 4 CN 111588745 A 说 明 书 3/4 页 图3为2.2中大孔树脂静态动力学曲线； 图4、5分别为2.3吸附动力学模型拟一级动力学和拟二级动力学回归线； 图6为2.4（1）不同上样液浓度梯度对黄酮吸附率的影响； 图7为2.4（2）不同pH对大孔树脂吸附率的影响； 图8为2.4（3）不同乙醇浓度对黄酮解吸率的影响； 图9为2.5（1）不同上样速度下的大孔树脂泄露曲线； 图10为2.5（2）不同洗脱速度和洗脱体积对大孔树脂纯化甘草地上部分总黄酮粗提物 的影响； 图11为步骤3甘草地上部分总黄酮清除DPPH自由基活性测定。 从图1可以看出标准曲线具有很好的线性关系（R2＞0.999）；图2和图3中HPD-100大孔 树脂的吸附率为76.5%和解吸率为86.3%明显高于其他树脂；图4、图5表明了能较好地描述 HPD-100大孔吸附树脂对黄酮的吸附动力学规律；图6、7、8分别表明了甘草地上部分总黄酮 在静态吸附过程得到的最优条件分别为：上样液浓度为1.62 mg/mL、上样液pH为5、洗脱液 乙醇浓度为70%；图9、图10为动态吸附过程当上样量增加到约170 ml（5 BV)时，上样速度为 1 BV/h开始有明显泄漏，并逐渐接近饱和，洗脱速度为2 BV/h，洗脱体积为2.5 BV达到最佳 上样量及洗脱效果；图11表明纯化后的甘草地上部分总黄酮DPPH自由基的清除效果接近 Vc，能达到85.3%。
本发明公开了一种HPD‑100大孔树脂对甘草地上部分总黄酮的纯化工艺。以甘草地上部分总黄酮为研究对象，通过静态动力学吸附研究其在HPD‑100大孔树脂上的吸附特性，结果表明，拟二级动力学模型（R2>0.99）能够较好地描述甘草地上部分总黄酮在HPD‑100树脂上的吸附过程。 全部
背景技术：
甘草地上部分富含黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、强心、镇静等作用，同时具有 明显的抗氧化、预防肿瘤等明显的药理作用。目前市场对甘草的需求量日益增加，然而，在 甘草的传统使用方法中只取用甘草根，而对地上部分未合理利用，同时对甘草纯化工艺并 不完善，因而不利于工业生产。大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的新型高分子 材料，具有物理化学稳定性高，比表面积大，吸附容量大，选择性好，吸附速度快，解吸条件 温和，再生处理方便，使用周期长，节省费用等多种优点，常用于中药材有效成分的分离纯 化。 文献（易运红等，大孔吸附树脂纯化甘草黄酮类化合物的研究，安徽农业科学，2016, 9 (05): 567-570）通过建立了HPLC-DAD高效液相指纹图谱很好地反映甘草地上部分脂溶性 黄酮类成分，具有良好的抗氧化能力。相关专利有：专利CN108261438A（刘忠英，一种甘草黄 酮组分的提取与纯化方法）中，以蒸馏水提取甘草有效成分，再经甲醇和乙酸乙酯处理对甘 草中黄酮组分粗分离，采用大孔树脂和聚酞胺树脂联合过柱法进行，该方法用水作为提取 溶剂，未能将黄酮类成分有效提取，并且整个方法周期太长、成本高。专利CN109303795A（许 云芳，一种甘草黄酮的提取方法）公开了一种甘草黄酮的提取方法，加入饱和醋酸铅水溶液 并通入硫化氢气体对甘草黄酮进行分离有效物质，该方法存在有机溶剂的残留和提取效率 低的问题。当前，采用大孔树脂分离纯化甘草地上部分总黄酮的文献和专利未见报道，本发 明通过对大孔树脂的筛选，并对其动力学进行研究，通过设计筛选成熟的工艺步骤和工艺 参数，以得到纯度高、生物活性好、质量稳定的甘草黄酮产品。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用绿色新型大孔吸附树脂纯 化甘草地上部分总黄酮的方法，通过设计筛选，并对吸附热力学及其动力学研究，得到成熟 的工艺步骤和工艺参数，以得到纯度高、生物活性好、质量稳定的甘草地上部分总黄酮产 品。 为实现上述目的，一种HPD-100大孔树脂对甘草地上部分总黄酮的纯化工艺步骤如下： 1.甘草地上部分粗提液的制备： 将甘草地上部分剪裁至小段，用粉碎机粉碎过80目筛，准确称取10-100 g甘草地上部 分粉末，加入10-20倍量乙醇溶液，在65-85℃条件下提取1-3 h，减压抽滤分离滤液和滤渣， 将滤渣重复提取1-3次，合并上清液，即得甘草地上部分粗提液。 2.甘草地上部分提取液总黄酮成分的纯化 2.1 大孔树脂预处理：大孔树脂用去离子水冲洗，除去白色漂浮物，吸水纸吸走树脂表 3 CN 111588745 A 说 明 书 2/4 页 面的水分，树脂用95%乙醇浸泡24-48 h。用去离子水淋洗树脂至无醇味，4% HCl溶液浸泡2- 5 h。用去离子水淋洗树脂至中性，4% NaOH溶液浸泡2 h，用去离子水淋洗树脂至中性，以滤 纸吸去树脂表面水分，备用。 2.2 大孔树脂的筛选：（1）准确秤取预处理好的4种大孔树脂4份于锥形瓶中，加入等量 的甘草地上部分粗提液置于恒温摇床反应5 h，定时取样。样品溶液定容，测定溶液吸光度， 计算得到不同大孔树脂对甘草黄酮的吸附率，同时绘制不同时刻不同树脂的静态吸附动力 学曲线（总黄酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定，绘制标准曲线，下同）。（2）取（1） 中吸附饱和的大孔树脂，分别加入浓度相同的醇溶液置于恒温摇床进行黄酮的解吸，5 h后 同法测定溶液吸光度，计算得到不同树脂的解吸率。 2.3 HPD-100大孔树脂吸附动力学模型回归线方程拟合：通过对2.2筛选得到HPD-100 型号树脂绘制静态吸附热力学曲线，通过拟一级动力学方程（1）和拟二级动力学方程（2）公 式得到吸附动力学模型拟合回归方程及其参数。预测HPD-100大孔树脂吸附动力学行为： 2.4 HPD-100大孔树脂的静态试验 （1）配制浓度为2.26 mg/ml甘草地上部分总黄酮粗提物溶液，再稀释为0.14-2.26 mg/ ml一系列浓度梯度的待测液，各加入一定量预处理的大孔树脂，恒温摇床反应，测定溶液吸 光度。 （2）取甘草地上部分总黄酮粗品溶解后定容，取50 mL溶液5份，调节至不同pH，再分别 加入一定量大孔树脂，恒温摇床反应，测定溶液吸光度 （3）取吸附饱和的树脂若干，均分为五份，分别加入50 mL不同浓度的乙醇进行解吸，测 定解吸溶液的吸光度。 2.5 HPD-100大孔吸附树脂的动态实验 （1）取一定量预处理HPD-100大孔树脂湿法装柱，树脂床柱体积为1 BV。使用SK-500Ⅲ 注射泵控制自动上样速度，每10 ml采集一次样品，测定吸光度（以上样溶液浓度的1/10为 泄露标准），绘制不同上样速度下的大孔树脂泄露曲线。 （2）将（1）吸附平衡的大孔树脂用去离子水洗涤，再用乙醇溶液洗脱，最后得到洗脱液， 每10 ml采集一次样品，绘制不同洗脱液流速与洗脱液体积对大孔树脂吸附效果的影响曲 线，最佳工艺验证，收集流出液浓缩至干，即得纯化后甘草地上部分总黄酮。 3.清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基活性测定：准确称取等量甘草地上部 分总黄酮粗提物和纯化物配置不同梯度浓度。称取15-50 mg DPPH试剂，以无水乙醇溶解至 1000 mL容量瓶，摇匀即得DPPH溶液，避光保存。分别取1 mL待测样液和3 mL DPPH溶液混合 摇匀，室温且避光反应30 min，于517 nm波长下测定吸光度值。以待测液溶剂为空白对照， 计算样品自由基清除率。同样方法制备L-抗坏血酸（Vc）对照品溶液。 附图说明： 图1为2.2甘草总黄酮含量测定标准曲线； 图2为2.2中不同树脂对黄酮的吸附率与解吸率的影响； 4 CN 111588745 A 说 明 书 3/4 页 图3为2.2中大孔树脂静态动力学曲线； 图4、5分别为2.3吸附动力学模型拟一级动力学和拟二级动力学回归线； 图6为2.4（1）不同上样液浓度梯度对黄酮吸附率的影响； 图7为2.4（2）不同pH对大孔树脂吸附率的影响； 图8为2.4（3）不同乙醇浓度对黄酮解吸率的影响； 图9为2.5（1）不同上样速度下的大孔树脂泄露曲线； 图10为2.5（2）不同洗脱速度和洗脱体积对大孔树脂纯化甘草地上部分总黄酮粗提物 的影响； 图11为步骤3甘草地上部分总黄酮清除DPPH自由基活性测定。 从图1可以看出标准曲线具有很好的线性关系（R2＞0.999）；图2和图3中HPD-100大孔 树脂的吸附率为76.5%和解吸率为86.3%明显高于其他树脂；图4、图5表明了能较好地描述 HPD-100大孔吸附树脂对黄酮的吸附动力学规律；图6、7、8分别表明了甘草地上部分总黄酮 在静态吸附过程得到的最优条件分别为：上样液浓度为1.62 mg/mL、上样液pH为5、洗脱液 乙醇浓度为70%；图9、图10为动态吸附过程当上样量增加到约170 ml（5 BV)时，上样速度为 1 BV/h开始有明显泄漏，并逐渐接近饱和，洗脱速度为2 BV/h，洗脱体积为2.5 BV达到最佳 上样量及洗脱效果；图11表明纯化后的甘草地上部分总黄酮DPPH自由基的清除效果接近 Vc，能达到85.3%。
