技术摘要：
海水中海地瓜幼体生物量的检测统计方法包括：提取海地瓜成体DNA，测序得到COⅠ基因序列；以PCR产物为起始标准品制作4个浓度梯度的标准品；设计荧光定量PCR特异性引物并验证，通过后得到CT值‑DNA浓度对数值的标准曲线；取不同干重海地瓜组织提取DNA，以不同干重的海地  全部
背景技术：
海地瓜(Aca ud ina  s pp) ，隶属棘皮动物门(Echinod e rma ta) ，海参纲 (Holothuroidea)，海参亚纲，芋参目(Molpadida)，尻参科(Caudinidae)，海地瓜属 (Acaudina)。该属有两个种——白肛海地瓜(Acaudina  leucoprocta  H.L.Clark)和海地瓜 (Acaudina  molpadioidea  Semper)。俗称海茄子，盛产于亚热带沙质海区，日本、菲律宾、印 度尼西亚，我国海南、广东、福建、浙江沿海均有。目前对于海地瓜的研究主要集中在海地瓜 的营养价值、药用价值以及生理功能方面，对海地瓜的生物量统计的报道较少，唐娅菲等研 究表明海地瓜在核电站附近海域能够引起核电站发生堵塞取水系统从而影响取水安全的 事件，对核电站的运行安全存在一定的威胁作用。针对核电站运行而言，海地瓜是一种致灾 生物，因此对其生物量的估算可以有效的采取措施控制海地瓜的数量，从而保障核电站的 健康运行。 目前浮游生物的估算方法主要有：血球计数法、分光光度计法、干重测量法、流式 细胞法等。目前对浮游生物的生物量统计主要是针对某一类，按直径大小，还比较缺少针对 海域某一种浮游生物的生物量的估算方法。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的问题和不足，提供一种海水中海地瓜幼体生物量的检 测统计方法，解决了针对某一海域中海地瓜幼体生物量的估算难题，能够较为快速、准确的 估算出某一海域海地瓜幼体的生物量，同时也能为其他水生生物幼体的估算提供参考。 本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的： 本发明提供一种海水中海地瓜幼体生物量的检测统计方法，其特点在于，其包括 以下步骤： S1、使用《海洋动物基因组DNA提取试剂盒》提取海地瓜成体DNA，设计海地瓜成体 DNA中COⅠ基因的引物，使用COⅠ基因的引物进行PCR扩增，测序得到COⅠ基因序列，将COⅠ基因 序列进行Blast比对，鉴定出该COⅠ基因序列为海地瓜的COⅠ基因序列； 其中，COⅠ基因的引物序列为： 上游序列：GACATGGCTTTCCCACGAATG 下游序列：GCTCGTGTGTCTACGTCCA PCR扩增时，其退火温度为53℃； S2、以步骤S1得到的PCR产物为起始标准品，制作4个浓度梯度10-2、10-3、10-4、10-5 的标准品； S3、根据测序得到的海地瓜COⅠ基因序列，设计荧光定量PCR特异性引物，并验证引 4 CN 111593096 A 说　明　书 2/5 页 物特异性，验证通过后，再通过荧光定量PCR绝对定量得到CT值-DNA浓度对数值的标准曲线 及对应的直线方程； 荧光定量PCR特异性引物序列为： 上游序列：GAGGTGTGGGTACAGGATGA 下游序列：CTTAGTAAGAGGAGGAAGGCGG PCR扩增时，其退火温度为：60℃； S4、取不同干重的海地瓜组织并提取DNA，并以不同干重的海地瓜组织所对应的 DNA为模板进行荧光定量PCR定量测试，根据步骤S3的标准曲线得到不同干重的海地瓜组织 的DNA所对应的浓度值，进而得到DNA质量与海地瓜组织干重的标准曲线及对应的直线方 程； S5、联立步骤S3中的CT值-DNA浓度对数值的直线方程和步骤S4中的DNA质量与海 地瓜组织干重的趋势直线方程，以得到海地瓜组织干重与CT值之间的推导关系式，通过荧 光定量PCR测出待测海水样品中DNA的CT值，并将CT值带入推导关系式计算可得到待测海水 样品中海地瓜幼体DNA的浓度值，根据待测海水样品中DNA体积，计算得到待测海水样品中 所含海地瓜幼体的DNA质量； S6、通过待测海水样品中海地瓜幼体的干湿重比例以及推导关系式计算得到海地 瓜幼体的湿重。 较佳地，步骤S3中，CT值-DNA浓度对数值的标准曲线的直线方程为：y＝-3.956x 13.139。 较佳地，步骤S4中，海地瓜组织的不同干重分别为：10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、 60mg、90mg、120mg。 较佳地，步骤S4中，DNA质量与海地瓜组织干重的标准曲线的直线方程式为：y＝ 0.2266x。 较佳地 ，步骤S 5中 ，海地瓜组织干重与C T值之间的推导关系式为 ： 表示海 地瓜测试干重；n标表示标准品浓度；CT测表示测试水样得到的CT值；V测表示水样DNA模板体 积；n测表示水样测试得到的目标DNA浓度；n标 测表示标准品与水样混合后的测试浓度。 较佳地，步骤S6中，干湿重比例为：26.2％。 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。 本发明的积极进步效果在于： 本发明提供一种快速检测海水水域中海地瓜的生物量，通过测试可以估算出海地 瓜生物量的暴发时期，从而为采取预防措施提供一定的时间准备，达到对海地瓜生物量的 暴发预警和致灾管控。 本发明通过从核电站海域的水样中提取DNA，设计特异性引物进行荧光定量PCR实 验得到CT值，并将测试得到的CT值直接带入推导公式可以直接较为准确、高效、快速地估算 出某一海域中幼体海地瓜的生物量，从而克服了传统估算方法的高工作量和高误差的弊 端，大幅度的减少时间、物质成本，降低工作量，能够预测核电站海域中海地瓜生物量的暴 发阈值和暴发时期，为核电站海域中海地瓜生物量的管控提供一定的预警和防范措施准备 5 CN 111593096 A 说　明　书 3/5 页 和其他海洋生物幼体的生物量估算提供一定的技术参考，具有良好的应用前景。 附图说明 图1为本发明较佳实施例的验证引物特异性的示意图，其中a：其他物种DNA混合 物；b：其他物种DNA混合物 海地瓜DNA模板；c：海地瓜DNA模板；d：水样环境DNA。 图2为本发明较佳实施例的熔解曲线的示意图。 图3为本发明较佳实施例的CT值-DNA浓度对数值的标准曲线示意图。 图4为本发明较佳实施例的DNA质量与海地瓜组织干重的标准曲线示意图。 图5为本发明较佳实施例的测试水样扩增曲线示意图。 图6为本发明较佳实施例的测试水样 目标DNA扩增曲线示意图。