技术摘要：
一种规模化制备血液中免疫细胞的方法，先向采血袋中加入PBS并混匀，得稀释的血液；接着，控制稀释的血液从采血袋缓慢流入分离袋中，确保稀释的血液层位于分离液上层。待稀释的血液完全转入分离袋中后，将采血袋弃去；将分离袋置于离心机中离心；最后，从离心机中取出分  全部
背景技术：
外周单个核细胞(Peripheral  Blood  Mononuclear  Cell，PBMC)制备，又称免疫细 胞制备，是指从人外周血中采集一定量的血液(如：100ml)，利用淋巴细胞分离液和离心机 等手段，采用密度梯度离心法去除血液样本中的红细胞和粒细胞等，分离获得PBMC的方法。 随着人们对健康重视程度的增加，免疫细胞存储被称为是“预留健康细胞，为生命备份”的 健康事业。 为了制取PBMC，目前通常的方法是：先用采血袋采集血液样本后，再将采集的血液 分装到50ml离心管中(常见血液采集量为100ml，需要分装3～5个离心管)，接着根据实验需 要，用缓冲液稀释血液样本，再将稀释后血液样本小心添加到含淋巴细胞分离液的离心管 中(一般100ml血液需要分装到5～10个离心管中)，经差速离心后，从底部到往上依次形成 红细胞和粒细胞富集层、分离液富集层、白膜层和血浆富集层等分层，最后收集“白膜层”细 胞，即PBMC所在的分层，再进行后续的细胞清洗、计数、扩增培养和冻存等操作。在此过程 中，一方面，血袋中的血必须先转移到离心管中分装，稀释后再转移并分装到含分离液的离 心管中，才可以进行差速离心。经过多次分装，生物样品暴露频次增加，染菌几率大大提高， 制备潜在污染风险高。另一方面，吸取分离液时要十分小心、慢速吸取，不能破坏分离层液 面，对操作人员的实验技能要求高。100ml血完成白膜层收集要从7个离心管中分别吸取，不 仅制备耗时长，也使得生物样品的染菌几率大大提高，不利于后续的细胞存储和使用。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，降低生物样品染 菌的风险，利于细胞的存储和使用。 本发明的另一个目的在于提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，实现从血液中 规模化制备免疫细胞，提高免疫细胞制取的效率。 本发明的再一个目的在于提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，使得从血液中 制取免疫细胞实现标准化。 本发明的又一个目的在于提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，提高从血液中 制取免疫细胞的自动化水平。 本发明的第五个目的在于提供一种装置，以实施从血液中制备免疫细胞的方法， 提高从血液中制取免疫细胞的自动化水平。 本发明的第六个目的在于提供一种装置，以实施从血液中制备免疫细胞的方法， 实现从血液中制取免疫细胞的标准化。 本发明提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，包括： 4 CN 111548992 A 说　明　书 2/5 页 先向采血袋中加入磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.4)并混匀，得稀释的血液； 接着，控制稀释的血液从采血袋缓慢流入分离袋中，确保稀释的血液层位于分离 液上层。待稀释的血液完全转入分离袋中后，将采血袋(联合采血针)弃去(如：热合分离)； 然后，将分离袋置于离心机中离心(如：15℃～22℃，速度650g～850g，时间25min ～35min)； 最后，从离心机中取出分离袋，置于压浆板(参见ZL2010206719788)上，使得分离 袋上层的血浆压至血浆收集袋中，再将白膜层压至密闭容器(如：离心管)，即从血液中分离 得PBMC。 本发明的方法，通常采用与血液等体积的PBS制得稀释的血液。 本发明的方法，准备分离袋时，需竖直放置分离袋，由加液口向分离袋中加入淋巴 细胞分离液(用量与稀释的血液保持等体积)，使分离液沉于分离袋底部，结束后封闭加液 口。 本发明的方法，还采用限流阀和管夹对流体的流速和方向进行控制。比如：将限流 阀调整到最小流量位置，打开管夹，通过限流阀控制稀释的血液从采血袋缓慢流入分离袋 中，确保血液层位于分离液上层。另如：关闭所有管夹和拧紧限流阀后，将分离袋置于离心 机中。又如：打开分离袋与血浆收集袋之间的管夹，用限流阀控制流速，并将上层血浆压至 血浆收集袋中，完成后关闭管夹，拧紧限流阀。 本发明的方法制得的PBMC后，还需要经过清洗和细胞计数后，加入适量冻存液后 进行分装冻存。步骤列举如下： 按白膜层∶PBS(v∶v)＝1∶3稀释并混匀后离心，离心条件为：15℃～22℃，30g～ 400g，时间5min～10min； 之后，弃PBS上清，在加入5ml～10ml  PBS，混匀后离心，离心条件为：15℃～20℃， 速度300g～400g，时间5min～10min； 离心后，弃PBS上清，用适量PBS充分重悬并混匀所有细胞，进行细胞计数； 最后，再次离心后，根据细胞计数结果，加入适量冻存液，将细胞分装冻存。 本发明的方法，可以在无菌的全密闭容器中操作，对环境的无菌要求低，可显著降 低制取的成本，提高了制取的便捷性，有利于从血液中规模化制取免疫细胞，不仅提高免疫 细胞的制取效率，也提高了其它血液制品的制取效率和安全性，比如：血浆收集袋中的血浆 可用于传染病检测等后续实验项目，或者制成血液制品。 本发明的方法器材简单，操作简便，易于实现血液制品的标准化，比如：PBMC和血 浆制品，以及自动化。 一种从血液中制备免疫细胞的标准化实施方式，包括： 步骤1：无菌采集外周血血液样本； 步骤2：将采血针进行热合剪断处理，取无菌注射器，采血针沿行管向采血袋中加 入PBS(用量通常与血液等体积)，混匀，制得稀释的血液； 步骤3：将限流阀调整到最小流量位置，打开卡扣，通过限流阀控制血液从采血袋 缓慢流入分离袋中，确保血液层位于分离液上层。待血液样本完全转入分离袋中后，将采血 袋联合采血针热合弃去。分离袋可预先准备，先竖直放置，向分离袋中加入与稀释的血液等 体积的淋巴细胞分离液，使分离液沉于分离袋底部，进针处热合封闭处理； 5 CN 111548992 A 说　明　书 3/5 页 步骤4：关闭所有卡扣，拧紧限流阀，将分离袋置于离心机中离心，条件为：温度15 ℃～22℃，速度650g～850g，时间25min～35min，调节离心机加、减速为低档； 步骤5：从离心机中小心取出分离袋，小心置于压浆板上，打开分离袋与血浆收集 袋之间的卡扣，用限流阀控制流速，将上层血浆压至血浆收集袋中，完成后关闭卡扣，拧紧 限流阀； 步骤6：打开分离袋与离心管之间的卡扣，用限流阀控制流速，将白膜层压至离心 管，关闭卡扣和限流阀； 步骤7：将离心管热合离断，或根据白膜层体积适量分装到离心管中，按白膜层∶ PBS(v∶v)＝1∶3稀释，混匀，离心(15℃～22℃，30g～400g，时间5min～10min)； 步骤8：弃PBS上清，加入PBS混匀，或将各个离心管中的细胞混合后，离心(15℃～ 20℃，速度300g～400g，时间5min～10min)； 步骤9：弃PBS上清，用适量PBS充分重悬并混匀所有细胞，进行细胞计数； 步骤10：将离心管进行离心(15℃～20℃，速度300g～400g，时间5min～10min)，根 据细胞计数结果，加入适量冻存液，将细胞分装冻存。 为了实施上述方法，本发明还提供一种装置，包括 第一容器，其用于采集并收集外周血血液，包括第一本体、采血器和采血管路； 第二容器，其用于对所采集的外周血血液实施分离，包括第二本体、第一连接管 路、第二连接管路和第三连接管路，第一连接管路与第一连接口连接； 第三容器，其与第二连接管路相连，用于收集来自于第二本体的血浆； 第四容器，其与第三连接管路相连，用于收集来自于第二本体的PBMC； 管夹，用于截断各个管路。 本发明的装置，第一连接管路、第二连接管路和第三连接管路上至少设置一个管 夹。 一种管夹的