技术摘要：
本发明公开了尖孢镰刀菌的RT‑QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法，属于生物技术领域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；试剂盒包括上述引物及探针。荧光定量PCR检测方法包括：提取待测样品总D 全部
背景技术：
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)可侵染多种植物引起维管束萎蔫病害，对农业 生产造成严重威胁。是植物根腐病的主要致病菌，能对三七、天麻、太子参、棉花等产生危 害。尖孢镰刀菌能侵入植物根部引起根腐或侵入植物维管束系统导致植物萎蔫枯死，并在 植物全生长过程中均可发生，其他菌株虽能侵入根部但不能侵入植物维管束系统引起病 害。该病会造成根部腐烂，导致植物吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要 表现为整株叶片发黄、枯萎。尖孢镰刀菌具有易变异以及多型性的特点，种内生力分化十分 明显，在种下又可分为多个专化性和生理小种，因此镰刀菌的遗传多样性一直是研究的热 点。多年来，人们都是依据形态学特征、致病性及营养体融合群等试验来研究该菌的的多态 性，而这些方法既费时又费力又不能准确地揭示物种的进化关系。 现有技术中，采用多重PCR检测尖孢镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其PCR结 果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。随着分子生物学技术的不断发展，RT- QPCR(实时荧光定量PCR)目前已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具 有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的 污染。但尖孢镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如腐皮镰刀菌、三线镰刀菌、禾 谷镰刀菌。因此提供一种用于尖孢镰刀菌的PCR检测方法，具有高度特异性，准确度高，成为 了本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，特异性好， 准确度高。 本发明的目的之二在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的探针。 本发明的目的之三在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒。 本发明的目的之四在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的方法。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 本发明通过对NCBI数据库中尖孢镰刀菌18SrRNA基因全序列进行生物信息学比对 分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，并进一步应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了多组实时荧光定量PCR引物与探 针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测尖孢镰刀菌的荧光定量PCR引物和探针。 本发明所述的尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，所述引物包括上游引物和下游 引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示， 上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'； 3 CN 111607657 A 说 明 书 2/11 页 下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'。 本发明所述的尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，该探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为 VIC，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。 18SrRNA基因广泛存在于尖孢镰刀菌中，具有很高的保守性。本发明采用尖孢镰刀 菌18SrRNA基因作为靶序列，合成了引物及探针。 本发明所述的尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物及探针组合，包括： 上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'； 下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'； 探针：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'。 本发明所述的一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒，包括上述的引物、及探 针。 本发明的技术方案中，该试剂盒还包括QPCR模板，该QPCR模板如SEQ ID NO:4所 示；优选地，所述模板是以质粒的形式存在。 本发明的引物和探针扩增片段对应质粒合成的核苷酸序列如SEQ ID NO:5 所示， 具体为： 5’-CGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGAT TCACTGAATTCTGCAATT CACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATC GATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATT TATTTATGGTTT TACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCG TCCCGTTTTACCGGGAGC-3’。 本发明的实施例中，该试剂盒还包括阴性样品；优选地，所述阴性对照样品为 ddH2O。 本发明的实施例中，还包括预混液；优选地，所述预混液为2×Probe Mix。 本发明所述的尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的反应体系，其包括： 上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'； 下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'； 探针：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'； 模板：如SEQ ID NO:4所示； 优选地，还包括阴性对照样品，进一步优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。 本发明所述的检测植物尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测方法，包括以下步骤： 步骤1.提取待测样品总DNA； 步骤2.制备反应体系，所述反应体系如上所述； 步骤3.将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品； 步骤4.将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和 探针，进行荧光定量PCR扩增； 步骤5.绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果； 优选地，所述步骤3中，梯度稀释制得的标准曲线样品的浓度分别为 3 .1× 109copies/μL、3.1×108copies/μL、3.1×107copies/μL、3.1×106copies/μL、 3 .1× 105copies/μL、3.1×104copies/μL、3.1×103copies/μL、3.1×102copies/μL、 3 .1× 4 CN 111607657 A 说 明 书 3/11 页 101copies/μL； 优选地，所述阳性对照样品的浓度为3.1×1010copies/μL。 本发明的实施例中，PCR反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min， 95℃ 15s、60℃40s、72℃20s并收集荧光信号，40个循环。 作为本发明的一个实施例，PCR反应体系为： 2×probe Mix 10μL Primer F(10μM) 0.4μL Primer R(10μM) 0.4μL TaqMan Probe(10μM) 0.2μL 模板 2μL ddH2O Up to 20μL。 本发明的技术方案中，采用PCR技术扩增尖孢镰刀菌18SrRNA基因，利用基因重组 技术将其连接到质粒载体PUC57中，构建出重组质粒PUC57-18SrRNA，并进行相应的PCR鉴定 和测序鉴定，最后经定量作为本发明方法的18SrRNA基因标准品。 本发明中18SrRNA基因标准品的制备方法包括： S1.提取尖孢镰刀菌(标准菌株)基因组DNA，得到DNA样本，用作 18SrRNA基因PCR 扩增的模板； S2.18SrRNA基因片段的PCR扩增：选取扩增序列，设计PCR引物和探针， S3.以S1得到的DNA样本为模板进行PCR扩增；而后对所得PCR扩增产物进行纯化； S4.将S3得到的纯化后的PCR扩增产物与质粒载体PUC57进行连接；再对连接产物 进行转化，得到转化了质粒的菌落； S5.挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质 粒PUC57-18SrRNA，用于菌液PCR鉴定和测序分析。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明选择包含高度保守、特异序列的尖孢镰刀菌18SrRNA基因，构建出重组质粒 PUC57-18SrRNA，作为标准品；再进一步筛选出用于检测尖孢镰刀菌的荧光定量PCR引物和 探针。本发明的尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针及试剂盒，具有高度特异 性和良好的灵敏度，能快速、准确度地尖孢镰刀菌进行检测。 附图说明 附图1为18SrRNA基因扩增序列NCBI数据库blast比对结果图。 附图2为本发明上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果图。 附图3为标准品的标准曲线图。 附图4为本发明灵敏度实验结果图；其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k 分别为不同质 粒浓度的相对荧光值曲线。其中，a代表质粒浓度为3.1×109copies/uL、b代表质粒浓度为 3.1×108copies/uL、c代表质粒浓度为 3 .1×107copies/uL、d代表质粒浓度为3.1× 106copies/uL、e代表质粒浓度为 3.1×105copies/uL、f代表质粒浓度为3.1×104copies/ uL、g代表质粒浓度为 3.1×103copies/uL、h代表质粒浓度为3.1×102copies/uL、i代表质 粒浓度为 3.1×101copies/uL和阴性对照。 5 CN 111607657 A 说 明 书 4/11 页 附图5为本发明特异性实验结果图。 附图6为本发明特异性实验凝胶成像验证图。
