技术摘要：
本发明属于生物医用材料与医疗器械领域，公开了一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料、制备方法及应用，所述自组装纳米纤维敷料含有季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层，所述季铵化甲壳素层与噬菌体层通过静电引力作用交替吸附于基材表面得到自组装纳  全部
背景技术：
Ⅱ型糖尿病源于胰岛素抵抗引发的代谢紊乱综合征，也是我国最主要的慢性非传 染性疾病之一。流行病学研究显示，糖尿病现患病例数已超过4亿，其中约60％患者需接受 不同类型治疗。重症患者由于皮层内血糖沉积破坏了胶原纤维的结构和生理功能，因而极 易出现糖尿病溃疡等继发病变，严重时可导致患者截肢甚至死亡。糖尿病溃疡区域血供差、 组织层次结构不清晰、创面长期不愈合，现有临床治疗方案均无有效报道。在此背景下，糖 尿病溃疡专用敷料拥有极大的市场潜力，在医疗器械领域估值达300亿美元。值得一提的 是，FDA批准的伤口敷料大多仅具有保湿或抗菌作用，而兼具促进皮肤血管化修复等多种生 物学功能的新型敷料却鲜有报道。 血管内皮生长因子(VEGF)具有加速血管内皮细胞增殖、迁移，改善局部血供及促 进组织再生等功能，受到临床医师及医疗器械研发者广泛且持续的关注；负载VEGF的复合 敷料具有较好的皮肤修复效果和应用价值。VEGF产量低、成本高，调查发现美国赛默飞世尔 公司1mg  VEGF市场价高达67000元，与之伴随的高昂医疗费用使VEGF复合敷料不得不止步 于实验室研发，影响市场化进程。
技术实现要素：
针对现有技术以上缺陷或改进需求中的至少一种，本发明提供了一种促进糖尿病 溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料、制备方法及应用，解决了现有糖尿病溃疡敷料存 在不能促进新生组织血管再生，长效抗菌性不佳，生物相容性不足和加工成本高等问题。本 发明中VEGF定向进化噬菌体层和季铵化甲壳素层交替排列，抗菌性较好的季铵化甲壳素和 成血管能力较好的VEGF定向进化噬菌体共同组装，获得的敷料兼具良好的成血管能力和抗 菌能力。 本发明将VEGF生长因子展示于M13噬菌体衣壳蛋白(PVIII)区域，获得的VEGF定向 进化噬菌体经由释放，可激活膜受体启动下游信号通路和生物过程。与天然VEGF相比，该定 向进化噬菌体具有如下优势：1.效价高，每个噬菌体上理论上能够展示3000个拷贝；2.成本 低，采用普通大肠杆菌培养噬菌体，经简单离心即可大量生产；3.缓释时间长，噬菌体为纳 米纤维，自身带有负电荷，通过正负电荷层层自组装技术可与季铵化甲壳素高效复合；因此 噬菌体可缓慢从复合层中持续释放。在季铵盐甲壳素与VEGF定向进化噬菌体持续性释放作 用下，发挥协同作用，解决细菌侵入与成血管因子高效递送的问题；保障皮损组织不受过度 炎性反应的影响，因此新型敷料可用于糖尿病溃疡血管化修复。 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种促进糖尿病溃疡血管化修 3 CN 111588901 A 说　明　书 2/5 页 复的自组装纳米纤维敷料； 所述自组装纳米纤维敷料含有季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层；所述季 铵化甲壳素层和噬菌体层交替排列；所述季铵化甲壳素层和噬菌体层通过静电引力相互作 用吸附；所述季铵化甲壳素层和噬菌体层数相同，且至少为1层。 优选地，所述自组装纳米纤维敷料还包括基材，且季铵化甲壳素层固定于所述基 材表面为自组装的起始层，也称季铵化甲壳素膜。 优选地，所述基材为丝素蛋白、聚己内酯、聚乙二醇中的任一或任意组合物形成的 纳米纤维膜。 优选的，所述基材的聚己内酯可以单独纺丝；也可以分别与丝素蛋白、聚乙二醇进 行混合电纺，组成质量比为聚己内酯：丝素蛋白＝4：1，或聚己内酯：聚乙二醇＝4：1。 优选地，所述季铵化甲壳素层和噬菌体层的层数均不多于40层。 为实现上述目的，按照本发明的另一个方面，还提供了一种促进糖尿病溃疡血管 化修复的自组装纳米纤维敷料的制备方法； 将季铵化甲壳素膜浸泡在噬菌体悬液中，使带正电荷的季铵化甲壳素与带负电荷 的M13噬菌体通过静电相互作用吸附，得到季铵化甲壳素层和噬菌体层自组装纳米纤维敷 料。 优选地，所述季铵化甲壳素膜固定在基材上；所述季铵化甲壳素膜固定在基材上 是先将基材浸泡在质量浓度为0.5-5％的季铵化甲壳素溶液中30min以上，取出晾干后浸泡 在2.5(w/v)％戊二醛乙醇水溶液中交联6-24h，磷酸盐缓冲液洗净后得到。所述乙醇水溶液 中乙醇的质量分数应大于50％。 优选地，所述基材是丝素蛋白、聚己内酯、聚乙二醇中的任一或任意其组合物通过 高压静电纺丝法制备得到。 优选地，所述自组装纳米纤维敷料是将季铵化甲壳素膜依次浸泡于VEGF定向进化 噬菌体悬液和季铵化甲壳素溶液中，通过层层自组装的方式，得到具有季铵化甲壳素层和 VEGF定向进化噬菌体层的自组装叠层敷料；设定先后分别浸泡在季铵化甲壳素溶液中为1 轮依次浸泡，所述依次浸泡的轮数至少为1轮。 优选地，所述依次浸泡的轮数不多于40轮。 优选地，将季铵化甲壳素膜依次浸泡于VEGF定向进化噬菌体悬液和季铵化甲壳素 溶液中时，季铵化甲壳素溶液的质量浓度为0.5-5％，VEGF定向进化噬菌体悬液的浓度为1 ×1011-1014PFU，浸泡在季铵化甲壳素溶液和噬菌体悬液中的时间均为10-60min。 为实现上述目的，按照本发明的另一个方面，还提供了一种如前所述的自组装纳 米纤维敷料、或如前所述的制备方法制得的自组装纳米纤维敷料在促进糖尿病溃疡血管化 修复中的应用。 上述优选技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效 果： (1)本发明中季铵化甲壳素带有正电荷，VEGF定向进化噬菌体带有负电荷。通过 LBL自组装技术可将季铵化甲壳素和VEGF定向进化噬菌体交替吸附于基材表面，固定后的 季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层稳定性得到显著性增强；获得的纳米纤维敷料具 4 CN 111588901 A 说　明　书 3/5 页 有优异的抗菌性和促血管生成的功能。上述纳米纤维敷料的生物学功能可通过自组装层数 实现简易调节。 (2)本发明中优选采用高压静电纺丝法制备纳米纤维膜，并将其作为基材。电纺纳 米纤维膜能够仿生细胞外基质相似的三维网络结构，具有比表面积高，生物相容性优良的 特点，是一种理想的自组装基材。另一方面，纳米纤维可引导上皮细胞由正常组织向病损区 域迁移，进而促进溃疡创面再上皮化。 (3)本发明获得的自组装纳米纤维敷料具有优异的生物相容性和促组织细胞再生 功能。动物实验表明，本发明可促进糖尿病大鼠皮肤溃疡修复，其促进作用与新生血管密度 增加有关。 (4)本发明制备方法简单可靠、加工设备简易、对环境污染小，产品附加值高，有望 得到工业化生产。本发明获得的自组装纳米纤维敷料可作为糖尿病溃疡专用敷料或其他创 面修复材料使用，有望得到临床推广。 附图说明 图1是实施例1获得的聚己内酯纳米纤维膜(空白组)扫描电子显微镜的结果； 图2是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))扫描电子显微镜的结 果； 图3是实施例1获得的聚己内酯纳米纤维膜(空白组)和自组装纳米纤维敷料(VEGF (工程型)和WT(野生型))体外细胞毒性实验的结果； 图4是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料VEGF(工程型)应用于糖尿病大鼠皮损 修复的实物图； 图5是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))和(WT(野生型))应用 于糖尿病大鼠皮损修复的愈合率。