技术摘要：
本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白IFN‑ELP(V)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用，所述融合蛋白IFN‑ELP(V)在通过瘤腔给药后，能明显浑浊并沉淀于瘤腔，形成药物储库并缓慢持续释放干扰素，产生原位免疫反应，早期抑制肿瘤的复发。同时术后与化疗联 全部
背景技术：
胶质母细胞瘤(GBM)恶性度高，预后极差。尽管外科技术取得了较大进步，但仍难 以完全切除，即使术后联合放疗和化疗，其复发依然难以控制。目前公认的手术切除联合术 后放化疗的综合治疗模式存在的缺陷：1、手术与随后放化疗之间的几周时间没有任何治 疗，在这段“治疗空白期”内残余肿瘤细胞已经开始增值；2、受损的血脑屏障依然有较高的 选择性，治疗药物无法通过系统给药有效到达中枢神经系统，从而杀伤肿瘤细胞。因此，术 中将抗肿瘤药物局部递送至GBM切除腔，是一种非常可行的方式。到目前为止，包含化疗试 剂卡莫司汀的可生物降解的 是美国食品药品管理局(FDA)唯一批准的用于术中局 部治疗GBM的药物。然而，由于该药物缓释差，且易流动不能有效固定于残腔，患者总体受益 并不明显。因此，迫切需要开发新的递药系统以有效抑制手术后GBM复发。 免疫疗法近年来已取得突破，但在GBM临床试验中未见明显效果，主要与GBM独特 的免疫抑制微环境相关。因此，克服GBM微环境中的免疫抑制作用可诱导有效的抗肿瘤免疫 反应。干扰素(IFN)是一种具有多种功能的细胞因子，已被多种恶性肿瘤的抗肿瘤研究，包 括GBM。同时，IFN可以与化疗药物能够产生协同作用。但是，IFN的短循环半衰期极大地限制 了它们在GBM治疗中的应用。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明首先提供了融合蛋白IFN-ELP(V)在制备预防或治疗胶 质母细胞瘤的药物中的应用。 本发明中的“融合蛋白IFN-ELP(V)”具体指IFN和ELP(V)的融合蛋白，其中，IFN指 干扰素，ELP(V)指类弹性蛋白多肽，且其多肽序列的重复单元为VGVPG。 作为优选，在所述融合蛋白IFN-ELP(V)中，ELP(V)的重复单元共重复30～180次， 优选重复60～120次，更优选重复90次。 作为优选，在所述融合蛋白IFN-ELP(V)中，ELP(V)融合于所述IFN的C末端。 本发明进一步提供了编码融合蛋白IFN-ELP(V)的核酸或含有所述核酸的生物材 料在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用，所述生物材料包括表达盒、载体、转座 子、工程菌、宿主细胞或细胞系。 当然，在此应用中的融合蛋白IFN-ELP(V)可以采用前述融合蛋白IFN-ELP(V)的优 选方案。 本发明进一步提供一种药物组合物，含有所述的融合蛋白IFN-ELP(V)和一种或多 种药学上适宜的赋形剂，所述药物组合物被配置成用于瘤腔给药。 3 CN 111603551 A 说 明 书 2/9 页 在神经胶质瘤治疗中，很少会有抗肿瘤药物适合于术中瘤腔原位给药，以抑制肿 瘤早期复发。然而本发明发现(作用机制示意图见图1)，融合蛋白IFN-ELP(V)在通过瘤腔给 药时具有很好的效果，经验证可以粘附着于瘤腔，不易移位，具有很好的应用效果，因此优 选所述药物组合物被配置成用于瘤腔给药。 在药物组合物中的融合蛋白IFN-ELP(V)也可以采用前述融合蛋白IFN-ELP(V)的 优选方案。 本发明在进一步探究中发现IFN-ELP(V)在与TMZ(替莫唑胺)联合给药时，在提升 原位免疫反应、抑制肿瘤复发等方面具有协同效果，因此优选所述药物组合物中还含有 TMZ。 本发明的有益效果如下： (1)本发明的融合蛋白及药物通过瘤腔给药后，能明显浑浊并沉淀于瘤腔，形成药 物储库并缓慢持续释放干扰素，产生原位免疫反应，第一时间抑制肿瘤的复发。同时术后与 化疗联合并产生协同作用，有效改善患者预后。 (2)本发明填补了肿瘤(尤其是GBM)手术与术后放化疗之间的“治疗空白期”，提供 了最早的术后干预措施以减少肿瘤复发。 (3)本发明发现了IFN-ELP(V)与化学疗法(TMZ)的协同作用，有利于其在临床中进 行更好的应用。 (4)本发明为肿瘤(尤其是GBM)治疗提供了一种生物安全的疗法。其中，IFN和TMZ 已被美国FDA批准用于癌症治疗，而ELP是具有生物相容性且可生物降解的生物聚合物，可 以减轻对机体的副作用。 附图说明 图1为本发明的作用机制示意图。 图2为本发明试验例1中通过ITC纯化获得IFN-ELP(V)和镍柱亲和层析纯化获得 IFN的结果示意图。 图3为本发明试验例1中的MALDI-TOF分析IFN-ELP(V)和IFN的分子量的结果示意 图； 图4为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的水合半径结果示意图； 图5为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的二级结构示意图； 图6为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的相转变特性及浓度依赖性结果示意 图；其中，a图为不同浓度的IFN-ELP(V)其温度变化与浑浊度变化关系，b图为IFN-ELP(V)的 浓度与相转变温度的关系； 图7为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)体外释放试验结果示意图； 图8为本发明试验例2中的IFN-ELP(V)和IFN体外生物活性结果示意图；其中，a图 为IFN-ELP(V)和IFN对人Daudi B细胞的抑制曲线，b图为IFN-ELP(V)和IFN对人源性U87MG 细胞的抑制作用； 图9为本发明试验例2中TMZ体外抑制增值情况结果示意图；其中，a图为TMZ对人源 性U87MG细胞的抑制作用，b图为TMZ分别与IFN-ELP(V)和IFN联合对U87MG细胞； 图10为本发明试验例3中IFN-ELP(V)和IFN在颅内最大使用剂量测定的结果示意 4 CN 111603551 A 说 明 书 3/9 页 图；其中，a图为IFN的测定结果，b图为IFN-ELP(V)的测定结果； 图11为活体成像技术显示本发明试验例3中颅内GBM肿瘤模型手术切除的结果示 意图； 图12为荧光显微镜下展示本发明试验例3中颅内GBM肿瘤模型手术切除的结果示 意图；其中，a图为切除前U87MG-mCherry-luc肿瘤的白光显微照片，b、c图为切除前后的荧 光显微照片； 图13为本发明试验例3中最大剂量IFN-ELP(V)和IFN在颅内GBM切除腔中形态结果 示意图； 图14为本发明试验例3中手术切除腔注射荧光标记的IFN-ELP(V)和IFN后荧光强 度变化的结果示意图；其中，a图为荧光变化示意图，b图为荧光强度定量示意图； 图15为本发明试验例3中手术切除腔注射最大量IFN-ELP(V)和IFN在裸鼠体内的 血药浓度随时间的变化及药时曲线面积随时间变化曲线的结果示意图；其中，a图为血药浓 度随时间的变化示意图，b图为药时曲线面积随时间变化示意图； 图16为本发明试验例4中IFN-ELP(V)和IFN在体内的生物分布结果示意图； 图17为本发明试验例5中手术切除腔置入最大耐受量IFN-ELP(V)和IFN后小鼠肿 瘤复发的活体成像结果示意图； 图18为本发明试验例5中的小鼠肿瘤荧光强度变化的定量及小鼠生存分析示意 图；其中，a图为肿瘤荧光强度变化的定量示意图，b图为小鼠生存曲线示意图； 图19为本发明试验例6中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠活体成像示意图； 图20为本发明试验例6中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肿瘤复发趋势示意 图； 图21为本发明试验例6中的各组小鼠术后21天脑组织标本形态及病理检测示意 图； 图22为本发明试验例6中的各组小鼠的体重变化示意图； 图23为本发明试验例6中的各组小鼠的生存曲线示意图； 图24为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小胶质细胞活化程度变 化的结果示意图； 图25为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组巨噬细胞颅内浸润程度 变化的结果示意图； 图26为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组巨噬细胞M1极化情况的 结果示意图；其中，a图为CD86的变化趋势，b图为Ly6C的变化趋势，c图为MHCII的变化趋势； 图27为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组中性粒细胞颅内浸润变 化的结果示意图； 图28为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组免疫因子变化的结果示 意图；其中，a图为IL-1β的变化示意图，b图为IL-12的变化示意图， 图29为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后裸鼠各脏器的组织学变化情 况的结果示意图； 图30为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠的血液分析的结果 示意图； 5 CN 111603551 A 说 明 书 4/9 页 图31为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠凝血功能变化的结 果示意图； 图32为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肝功能变化情况的 结果示意图； 图33为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肾功能变化情况的 结果示意图； 图34为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠心肌酶谱变化情况 的结果示意图；
本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白IFN‑ELP(V)在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用，所述融合蛋白IFN‑ELP(V)在通过瘤腔给药后，能明显浑浊并沉淀于瘤腔，形成药物储库并缓慢持续释放干扰素，产生原位免疫反应，早期抑制肿瘤的复发。同时术后与化疗联 全部
背景技术：
胶质母细胞瘤(GBM)恶性度高，预后极差。尽管外科技术取得了较大进步，但仍难 以完全切除，即使术后联合放疗和化疗，其复发依然难以控制。目前公认的手术切除联合术 后放化疗的综合治疗模式存在的缺陷：1、手术与随后放化疗之间的几周时间没有任何治 疗，在这段“治疗空白期”内残余肿瘤细胞已经开始增值；2、受损的血脑屏障依然有较高的 选择性，治疗药物无法通过系统给药有效到达中枢神经系统，从而杀伤肿瘤细胞。因此，术 中将抗肿瘤药物局部递送至GBM切除腔，是一种非常可行的方式。到目前为止，包含化疗试 剂卡莫司汀的可生物降解的 是美国食品药品管理局(FDA)唯一批准的用于术中局 部治疗GBM的药物。然而，由于该药物缓释差，且易流动不能有效固定于残腔，患者总体受益 并不明显。因此，迫切需要开发新的递药系统以有效抑制手术后GBM复发。 免疫疗法近年来已取得突破，但在GBM临床试验中未见明显效果，主要与GBM独特 的免疫抑制微环境相关。因此，克服GBM微环境中的免疫抑制作用可诱导有效的抗肿瘤免疫 反应。干扰素(IFN)是一种具有多种功能的细胞因子，已被多种恶性肿瘤的抗肿瘤研究，包 括GBM。同时，IFN可以与化疗药物能够产生协同作用。但是，IFN的短循环半衰期极大地限制 了它们在GBM治疗中的应用。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明首先提供了融合蛋白IFN-ELP(V)在制备预防或治疗胶 质母细胞瘤的药物中的应用。 本发明中的“融合蛋白IFN-ELP(V)”具体指IFN和ELP(V)的融合蛋白，其中，IFN指 干扰素，ELP(V)指类弹性蛋白多肽，且其多肽序列的重复单元为VGVPG。 作为优选，在所述融合蛋白IFN-ELP(V)中，ELP(V)的重复单元共重复30～180次， 优选重复60～120次，更优选重复90次。 作为优选，在所述融合蛋白IFN-ELP(V)中，ELP(V)融合于所述IFN的C末端。 本发明进一步提供了编码融合蛋白IFN-ELP(V)的核酸或含有所述核酸的生物材 料在制备预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用，所述生物材料包括表达盒、载体、转座 子、工程菌、宿主细胞或细胞系。 当然，在此应用中的融合蛋白IFN-ELP(V)可以采用前述融合蛋白IFN-ELP(V)的优 选方案。 本发明进一步提供一种药物组合物，含有所述的融合蛋白IFN-ELP(V)和一种或多 种药学上适宜的赋形剂，所述药物组合物被配置成用于瘤腔给药。 3 CN 111603551 A 说 明 书 2/9 页 在神经胶质瘤治疗中，很少会有抗肿瘤药物适合于术中瘤腔原位给药，以抑制肿 瘤早期复发。然而本发明发现(作用机制示意图见图1)，融合蛋白IFN-ELP(V)在通过瘤腔给 药时具有很好的效果，经验证可以粘附着于瘤腔，不易移位，具有很好的应用效果，因此优 选所述药物组合物被配置成用于瘤腔给药。 在药物组合物中的融合蛋白IFN-ELP(V)也可以采用前述融合蛋白IFN-ELP(V)的 优选方案。 本发明在进一步探究中发现IFN-ELP(V)在与TMZ(替莫唑胺)联合给药时，在提升 原位免疫反应、抑制肿瘤复发等方面具有协同效果，因此优选所述药物组合物中还含有 TMZ。 本发明的有益效果如下： (1)本发明的融合蛋白及药物通过瘤腔给药后，能明显浑浊并沉淀于瘤腔，形成药 物储库并缓慢持续释放干扰素，产生原位免疫反应，第一时间抑制肿瘤的复发。同时术后与 化疗联合并产生协同作用，有效改善患者预后。 (2)本发明填补了肿瘤(尤其是GBM)手术与术后放化疗之间的“治疗空白期”，提供 了最早的术后干预措施以减少肿瘤复发。 (3)本发明发现了IFN-ELP(V)与化学疗法(TMZ)的协同作用，有利于其在临床中进 行更好的应用。 (4)本发明为肿瘤(尤其是GBM)治疗提供了一种生物安全的疗法。其中，IFN和TMZ 已被美国FDA批准用于癌症治疗，而ELP是具有生物相容性且可生物降解的生物聚合物，可 以减轻对机体的副作用。 附图说明 图1为本发明的作用机制示意图。 图2为本发明试验例1中通过ITC纯化获得IFN-ELP(V)和镍柱亲和层析纯化获得 IFN的结果示意图。 图3为本发明试验例1中的MALDI-TOF分析IFN-ELP(V)和IFN的分子量的结果示意 图； 图4为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的水合半径结果示意图； 图5为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的二级结构示意图； 图6为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)和IFN的相转变特性及浓度依赖性结果示意 图；其中，a图为不同浓度的IFN-ELP(V)其温度变化与浑浊度变化关系，b图为IFN-ELP(V)的 浓度与相转变温度的关系； 图7为本发明试验例1中的IFN-ELP(V)体外释放试验结果示意图； 图8为本发明试验例2中的IFN-ELP(V)和IFN体外生物活性结果示意图；其中，a图 为IFN-ELP(V)和IFN对人Daudi B细胞的抑制曲线，b图为IFN-ELP(V)和IFN对人源性U87MG 细胞的抑制作用； 图9为本发明试验例2中TMZ体外抑制增值情况结果示意图；其中，a图为TMZ对人源 性U87MG细胞的抑制作用，b图为TMZ分别与IFN-ELP(V)和IFN联合对U87MG细胞； 图10为本发明试验例3中IFN-ELP(V)和IFN在颅内最大使用剂量测定的结果示意 4 CN 111603551 A 说 明 书 3/9 页 图；其中，a图为IFN的测定结果，b图为IFN-ELP(V)的测定结果； 图11为活体成像技术显示本发明试验例3中颅内GBM肿瘤模型手术切除的结果示 意图； 图12为荧光显微镜下展示本发明试验例3中颅内GBM肿瘤模型手术切除的结果示 意图；其中，a图为切除前U87MG-mCherry-luc肿瘤的白光显微照片，b、c图为切除前后的荧 光显微照片； 图13为本发明试验例3中最大剂量IFN-ELP(V)和IFN在颅内GBM切除腔中形态结果 示意图； 图14为本发明试验例3中手术切除腔注射荧光标记的IFN-ELP(V)和IFN后荧光强 度变化的结果示意图；其中，a图为荧光变化示意图，b图为荧光强度定量示意图； 图15为本发明试验例3中手术切除腔注射最大量IFN-ELP(V)和IFN在裸鼠体内的 血药浓度随时间的变化及药时曲线面积随时间变化曲线的结果示意图；其中，a图为血药浓 度随时间的变化示意图，b图为药时曲线面积随时间变化示意图； 图16为本发明试验例4中IFN-ELP(V)和IFN在体内的生物分布结果示意图； 图17为本发明试验例5中手术切除腔置入最大耐受量IFN-ELP(V)和IFN后小鼠肿 瘤复发的活体成像结果示意图； 图18为本发明试验例5中的小鼠肿瘤荧光强度变化的定量及小鼠生存分析示意 图；其中，a图为肿瘤荧光强度变化的定量示意图，b图为小鼠生存曲线示意图； 图19为本发明试验例6中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠活体成像示意图； 图20为本发明试验例6中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肿瘤复发趋势示意 图； 图21为本发明试验例6中的各组小鼠术后21天脑组织标本形态及病理检测示意 图； 图22为本发明试验例6中的各组小鼠的体重变化示意图； 图23为本发明试验例6中的各组小鼠的生存曲线示意图； 图24为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小胶质细胞活化程度变 化的结果示意图； 图25为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组巨噬细胞颅内浸润程度 变化的结果示意图； 图26为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组巨噬细胞M1极化情况的 结果示意图；其中，a图为CD86的变化趋势，b图为Ly6C的变化趋势，c图为MHCII的变化趋势； 图27为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组中性粒细胞颅内浸润变 化的结果示意图； 图28为本发明试验例7中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组免疫因子变化的结果示 意图；其中，a图为IL-1β的变化示意图，b图为IL-12的变化示意图， 图29为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后裸鼠各脏器的组织学变化情 况的结果示意图； 图30为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠的血液分析的结果 示意图； 5 CN 111603551 A 说 明 书 4/9 页 图31为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠凝血功能变化的结 果示意图； 图32为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肝功能变化情况的 结果示意图； 图33为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠肾功能变化情况的 结果示意图； 图34为本发明试验例8中的IFN-ELP(V)与TMZ联合后各组小鼠心肌酶谱变化情况 的结果示意图；
