技术摘要：
本文所公开的是表达21‑羟化酶(21OH)蛋白的重组腺相关病毒载体以及用于治疗21OH缺乏症的相关用途。
背景技术：
21-羟化酶(21OH)是涉及类固醇激素醛固酮和皮质醇的生物合成的由CYP21A2基 因编码的细胞色素P450酶。这些合成发生在肾上腺皮质中。由基因转换而非点突变驱动的 功能性CYP21A2基因与密切相关的非功能性CYP21A1P假基因之间的高重组率导致了先天性 肾上腺增生(CAH)的高发病率和其不寻常的遗传学。CYP21A2的缺乏引起21-羟化酶缺乏症 (21OHD)，这导致以下两种情况中的任一种：i)胎儿外生殖器雄性化、低量产生或没有产生 糖皮质激素和盐皮质激素并且雄激素大量过量的CAH(“经典”21OHD)或ii)无胎儿雄性化、 无皮质醇和醛固酮缺乏但是雄激素的产生有所增加的更轻微形式的所述疾病(“非经典” 21OHD)。 在几十年的治疗性策略之后，对严重形式的21OHD的管理仍存在临床挑战性。当可 以用外源性类固醇治疗患者时，婴儿和成人患者仍存在肾上腺危象—婴儿和成人患者的肾 上腺无法对如常规感染、创伤或剧烈运动等身体应力作出响应—的风险。肾上腺危象甚至 在顺应疗法的受过良好教育的患者中也会快速导致严重休克和死亡。参见Hahner等人《, 临 床内分泌代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab)》,2月；100(2):407-416(2015)。另外，存在 与成长、性别和性征有关的显著后果。在女性患者中，使用超生理的糖皮质激素剂量抑制肾 上腺雄激素的产生存在一定的难度。因此，交替循环的雄激素与糖皮质激素过量会导致身 材矮小、肥胖症、儿童时期重复的生殖器手术、青春期的改变和长期男性化。对于患有因多 毛症、雄性肌肉发达、阴蒂增大和性征受损引起的经典和非经典形式的疾病的女性患者，雄 激素增多症仍然是主要美容负担。参见Gastaud等人《, 临床内分泌代谢杂志》,92(4) ,1391- 1396(2007)。男性患者存在身材矮小和过早男性化的风险。治疗失败甚至会导致一些患者 切除双侧肾上腺(Gmyrek等人《, 儿科(Pediatrics)》,109；E28(2002)；Bruining等人《, 临床 内分泌代谢杂志》,86,482-484(2001))。 仍然需要允许持续校正21OHD的疗法。 4 CN 111601620 A 说 明 书 2/37 页
技术实现要素：
本发明涵盖一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述rAAV载体包括核酸分子，所述 核酸分子包括至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)和对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编码的 非AAV核苷酸序列，所述非AAV核苷酸序列可操作地连接到启动子。 在某些情况下，rAAV载体对是人21OH蛋白的21OH蛋白进行编码。在一些实施例中， 对21OH蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列包括人21OH(CYP21A2)cDNA或由其组成。在某些实 施例中，对21OH蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列对SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列进行编码。 一种rAAV载体可以包括核酸分子，所述核酸分子包括至少一个AAV反向末端重复 序列(ITR)和对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列，所述非AAV核苷酸序列 可操作地连接到启动子，其中所述启动子引导所述21OH蛋白在宿主细胞(例如，肾上腺细胞 或肾上腺皮质细胞)中的表达。适合的启动子的非限制性实例包含巨细胞病毒/β-肌动蛋白 杂合启动子、PGK启动子或对肾上腺皮质细胞中的表达具有特异性的启动子。在一些实施例 中，巨细胞病毒/β-肌动蛋白杂合启动子是CAG、CB6或CBA启动子。在一些实施例中，启动子 包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的核苷酸序列或由其组成。 在一些方面，rAAV载体包括至少一个ITR序列。在某些实施例中，ITR是AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型ITR。 在某些情况下，本发明的rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型。 本发明进一步提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述rAAV载体包括核酸分 子，所述核酸分子包括对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列，所述非AAV核 苷酸序列可操作地连接到启动子，其中所述rAAV载体包括至少一个AAV反向末端重复序列 (ITR)，其中所述ITR来自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74的AAV；并且其中所述启动子是巨细胞病毒/β-肌动蛋白杂 合启动子、PGK启动子或对肾上腺皮质细胞中的表达具有特异性的启动子。在一些实施例 中，巨细胞病毒/β-肌动蛋白杂合启动子是CAG、CB6或CBA启动子。 在一些方面，本发明涵盖一种rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包括本文所述的rAAV载体。 在一些实施例中，rAAV颗粒进一步包括至少一种衣壳蛋白，所述至少一种衣壳蛋白来自AAV 血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或 rh74。 本发明还涵盖一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所述的rAAV载体或rAAV 颗粒以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。另外，本发明设想了一种生产rAAV颗粒的 方法，所述方法包括培养宿主细胞，所述宿主细胞含有：(a)本文所述的rAAV载体；(b)对 AAVrep进行编码的核酸分子；(c)对至少一种AAV衣壳蛋白进行编码的核酸分子；以及(d)用 于包装所述rAAV颗粒的充分辅助功能。 在某些情况下，本发明提供了一种在有需要的受试者体内表达21-羟化酶(21OH) 的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的rAAV颗粒或包括此类rAAV颗粒的药 物组合物，从而在所述受试者体内表达21OH，所述rAAV颗粒包括rAAV载体，所述rAAV载体包 括核酸分子，所述核酸分子包括至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)和对21-羟化酶 5 CN 111601620 A 说 明 书 3/37 页 (21OH)蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列，所述非AAV核苷酸序列可操作地连接到启动子。 在一些情况下，可以在所述受试者的肾上腺皮质、肾上腺髓质、肾上腺干细胞、肾上腺祖细 胞、肝脏或卵巢中表达21OH。 本发明进一步提供了一种治疗患有21-羟化酶缺乏症(21OHD)的受试者的方法，所 述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的rAAV颗粒或包括此类rAAV颗粒的药物组合物， 从而治疗所述受试者的21OHD，所述rAAV颗粒包括rAAV载体，所述rAAV载体包括核酸分子， 所述核酸分子包括至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)和对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编 码的非AAV核苷酸序列，所述非AAV核苷酸序列可操作地连接到启动子。此方法可以进一步 包括在施用步骤之前选择患有21OHD的受试者。 在一些情况下，静脉内、通过经由开放性手术或腹腔镜检查直接注入肾上腺中或 通过经由导管插入注入肾上腺动脉中向所述受试者施用rAAV载体或rAAV颗粒或包括此类 rAAV载体或rAAV颗粒的药物组合物。直接注入肾上腺中可以是直接注入所述肾上腺皮质 中。 通过本发明的方法或组合物治疗的受试者可能患有21OHD的普拉德IV期或V期类 型。在一些情况下，受试者患有先天性肾上腺增生(CAH)。 本发明还设想了一种rAAV载体或包括此类载体的rAAV颗粒的用途，其用于制造用 于治疗21-羟化酶缺乏症的药物，所述rAAV载体包括核酸分子，所述核酸分子包括至少一个 AAV反向末端重复序列(ITR)和对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列，所述 非AAV核苷酸序列可操作地连接到启动子。 附图说明 图1A-图1C示出了注射有CYP21载体(灰色，n＝16)或假载体(黑色，n＝9)的 Cyp21-/-小鼠与被视为“对照”小鼠(白色，n＝21)的Cyp21 /-和Cyp21 / 相比的体重和尿孕酮 的演进。图1A是示出注射有假载体的Cyp21-/-小鼠始终保持比对照小鼠更小的条形图(P< 0.001)。注射有CYP21载体的小鼠在注射后5周和10周(P<0.001)以及注射后15周(P<0.01) 体重显著恢复。图1B示出了在载体注射前和杀死时注射有假载体(左)或CYP21载体(中)的 Cyp21-/-小鼠和对照小鼠(右)的照片。图1C是示出注射有假载体的Cyp21-/-小鼠与对照小鼠 (P<0.001)相比始终具有高得多的尿孕酮浓度的条形图。用CYP21载体进行的基因疗法诱导 尿孕酮大量减少。然而，校正并不完整。与对照小鼠相比，经CYP21处理的Cyp21-/-小鼠的孕 酮水平仍然大约高两倍(注射后5周时P<0.001，注射后10周时无显著性，并且注射后15周时 P<0.05)。数据呈现为平均值±平均数标准误差(s.e.m.)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 图2A-图2F是示出注射有CYP21载体(灰色，n＝14)或假载体(黑色，n＝13)的 Cyp21-/-小鼠与对照(白色，n＝19)相比的运动和应激应答的研究结果的条形图。图2A示出 注射有CYP21或假载体的Cyp21-/-小鼠和对照小鼠具有如通过转棒评估的相当的运动表现。 图2B示出注射有假载体的Cyp21-/-小鼠在悬尾测试中与对照小鼠相比更不移动(对照与假 载体小鼠之间的P＝0.21)。用CYP21载体处理的Cyp21-/-小鼠恢复了对测试的正常应答(对 照与CYP21载体小鼠之间的P<0.05)。图2C-2F示出与高架十字迷宫测试(elevated plus- mazetest)中注射有CYP21载体的Cyp21-/-小鼠和对照小鼠相比，注射有假载体的Cyp21-/-小 鼠行进了更小的距离(对照与假载体小鼠之间的P<0.001)(图2C)，在开放臂中花费的时间 6 CN 111601620 A 说 明 书 4/37 页 更少(对照与假载体小鼠之间无显著性)(图2D)，进行了更少探头次数(head-dipping)(对 照与假载体小鼠之间的P<0.05)(图2E)和后腿站立移动(对照与假载体小鼠之间的P<0.01) (图2F)。对于所有高架十字迷宫参数，对照与CYP21载体之间的差异不显著。数据呈现为平 均值±平均数标准误差。*P<0.05，***P<0.001。 图3A和图3B是示出注射有CYP21载体(灰色，n＝11)或假载体(黑色，n＝8)的 Cyp21-/-小鼠与对照小鼠(白色，n＝16)相比的肾上腺和肾脏中的基因表达的研究结果的条 形图。图3A示出CYP21注射的小鼠的肾上腺相比于针对ACTH受体(Mc2r)、蛋白激酶A调节亚 单位(Prkar2a)、类固醇生成因子1(SF-1)(P<0.01)、类固醇生成急性调节蛋白(Star)和类 固醇生成酶Cyp17a1和Cyp11b2(P<0.05)的mRNA含量。CYP21注射的小鼠的mRNA含量与对照 相比仍有所增加，即使对于SF-1、Star、Hsd3b1(P<0.05)、Prkar1a、Cyp11b1(P<0.01)、Mc2r、 Prkar2a和Cyp11b2(P<0.001)的水平较低，并且对于Prkarca、Prkarcb、Cyp11a1和Cyp17a1 的水平则没有变化。图3B示出CYP21注射的小鼠相对于假载体的肾脏中的肾素mRNA含量降 低(P<0.001)，尽管当将CYP21注射的小鼠与对照相比时，所述肾素mRNA含量仍有所增加(P< 0 .001)。数据相对于Tbp归一化，并且呈现为平均值±平均数标准误差。*P<0 .05，**P< 0.01，***P<0.001。 图4A和图4B示出了用pCYP21(n＝3，灰色)或pLuc(n＝3，黑色)转染的Y1细胞中21- 羟化酶表达和孕酮浓度的分析结果。图4A示出用pCYP21转染的Y1细胞与用pLuc转染的Y1细 胞相比如通过蛋白质印迹评估的表达21-羟化酶。图4B示出用pCYP21转染的Y1细胞在上清 液中的孕酮浓度低于用pLuc转染的Y1细胞(P＝0.10)。数据呈现为平均值±平均数标准误 差。 图5A和图5B示出静脉内注射AAVrh10引起肾上腺皮质中的转基因表达。图5A是示 出在对照小鼠中静脉内注射后肾上腺中AAVrh10的GFP荧光图案的图像。图5B是示出用 CYP21载体处理的对照和Cyp21-/-小鼠的肾上腺中小鼠和人21-羟化酶表达的免疫印迹。 图6示出了对照小鼠和注射有假载体或CYP21载体的Cyp21-/-小鼠的肾上腺冷冻切 片的组织学分析图像。顶部，比例尺＝500μm；底部，比例尺＝200μm。 图7示出了对照小鼠和注射有假载体或CYP21载体的Cyp21-/-小鼠的肾上腺中的醛 固酮合酶表达的图像。 图8A和图8B示出了静脉内注射有AAVrh10-CAG-GFP的对照小鼠外围器官中的GFP 表达的图像。图8A示出了心脏。图8B示出了肝脏。 图9示出了在左肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-GFP的非人灵长类动物1号(NHP01)的 肾上腺的GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(未经注射)和左侧(经过注射)肾 上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图10示出了注射有ssAAV5-PGK-GFP的非人灵长类动物1号(NHP01)的左肾上腺的 GFP免疫荧光图像。 图11示出了注射有ssAAV5-PGK-GFP的非人灵长类动物1号(NHP01)的左肾上腺的 整个切片的GFP免疫荧光图像。 图12示出了在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物1号 (NHP01)的肾上腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(经过注射)和左 侧(未经注射)肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 7 CN 111601620 A 说 明 书 5/37 页 图13示出了注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物1号(NHP01)的右肾上 腺的HA免疫荧光图像。 图14示出了在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物2号 (NHP02)的肾上腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(经过注射)和左 侧(未经注射)肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 在右肾上腺中，向此动物以三次注射的方式施用4.5×1011vg。此值比施用NHP01的值低6.6 倍。 图15示出了注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物2号(NHP02)的右肾上 腺中的HA免疫荧光图像。在右肾上腺中，向此动物以三次注射的方式施用4.5×1011vg。此值 比施用NHP01的值低6.6倍。 图16示出了在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物4号 (NHP04)的肾上腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(经过注射)和左 侧(未经注射)肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图17示出了在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA后，非人灵长类动物4号 (NHP04)的右肾上腺的解剖细节的示意图和照片。 图18示出了来自在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物4号 (NHP04)的切成小片的肾上腺中的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果空间分布的示意 图。推定的注射部位用黑色箭头指示。 图19示出了在手术结束(ES)时和安乐死(Eu)后，在NHP01和NHP02的肝脏中 ssAAV5-PGK-CYP21HA的平均CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。图19还示出了注射有 ssAAV5-PGK-CYP21HA的NHP01、NHP02和NHP04的肝脏的HA免疫荧光图像。 图20示出了静脉内施用ssAAV5-PGK-GFP的野生型小鼠的肾上腺的GFP病毒基因组 拷贝(VGC)测量结果。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。图20还示出了静 脉内用ssAAV5-PGK-GFP处理的野生型小鼠的肾上腺的免疫荧光图像。 图21示出了静脉内施用ssAAV5-PGK-CYP21HA的野生型小鼠的肾上腺的CYP21HA病 毒基因组拷贝(VGC)测量结果。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图22示出了在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物2号(NHP02) 的肾上腺的GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(未经注射)和左侧(经过注射) 肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图23示出了注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物2号(NHP02)的左肾上腺的 GFP免疫荧光图像。 图24示出了在注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物2号(NHP02)的左肾上腺 中的所选阳性GFP免疫荧光图像。“OBJX20”是指放大率×20。 图25示出了注射有ssAAV6-CAG-GFP的NHP02的左肾上腺的GFP免疫荧光图像。此图 示出了免疫荧光信号在肾上腺各片上的不等分布。 图26示出了在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物4号(NHP04) 的肾上腺的GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(未经注射)和左侧(经过注射) 肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图27示出了在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP后，非人灵长类动物4号(NHP04) 8 CN 111601620 A 说 明 书 6/37 页 的左肾上腺的解剖细节的示意图和照片。 图28示出了来自在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物4号 (NHP04)的切成小片的两个肾上腺中的GFP VGC测量结果空间分布的分布。 图29示出了在手术结束(ES)时和安乐死(Eu)后，在注射有ssAAV6-CAG-GFP的 NHP02和NHP04的肝脏中的平均GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。图29还示出了在左肾上 腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的NHP04的肝脏的GFP免疫荧光图像。 图30示出了在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的NHP04的肝脏的另一个GFP免 疫荧光图像。 图31示出了静脉内施用ssAAV6-CAG-GFP的野生型小鼠的肾上腺的GFP病毒基因组 拷贝(VGC)测量结果。图31还示出了静脉内用ssAAV6-CAG-GFP处理的野生型小鼠的肾上腺 的GFP免疫荧光图像。 图32示出了通过IP(腹膜内)注射或IH(肝内)注射用ssAAV6-CAG-GFP处理的野生 型小鼠肾上腺的GFP免疫荧光图像。 图33示出了在左肾上腺中注射有ssAAV1-CB6-GFP的非人灵长类动物3号(NHP03) 的肾上腺的GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(未经注射)和左侧(经过注射) 肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图34示出了注射有ssAAV1-CB6-GFP的非人灵长类动物3号(NHP03)的左肾上腺的 GFP免疫荧光图像。 图35示出了在手术结束(ES)时和安乐死(Eu)后，NHP03的肝脏中ssAAV1-CB6-GFP 的平均GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。图35还示出了在左肾上腺中注射有ssAAV1- CB6-GFP的NHP03的肝脏的GFP免疫荧光图像。 图36示出了静脉内施用ssAAV1-CB6-GFP的野生型小鼠的肾上腺的GFP病毒基因组 拷贝(VGC)测量结果。图36还示出了静脉内用ssAAV1-CB6-GFP处理的野生型小鼠的肾上腺 的GFP免疫荧光图像。 图37示出了在右肾上腺中注射有ssAAV1-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物3号 (NHP03)的肾上腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(经过注射)和左 侧(未经注射)肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图38示出了注射有ssAAV1-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物3号(NHP03)的右肾上 腺的HA免疫荧光图像。在右肾上腺中，向动物以两次注射的方式施用2.2×1012。 图39示出了在手术结束(ES)时和安乐死(Eu)后，在右肾上腺中注射有ssAAV1- PGK-CYP21HA的NHP03的肝脏中的CYP21HA平均病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。图39还示出 了在右肾上腺中注射有ssAAV1-PGK-CYP21HA的NHP03的肝脏的HA免疫荧光图像。 图40示出了静脉内施用1×1014vg/kg ssAAV1-PGK-CYP21HA的野生型小鼠的肾上 腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。 图41A和图41B示出了总结在不同时间点在NHP01、NHP02、NHP03和NHP04中的GFP (图41A)和hCYP21HA(图41B)的血液VGC的测量结果的线形图。图41C示出了总结手术结束时 作为肾上腺内注射剂量的函数的血液VGC的图。vg＝病毒基因组。“H 1”代表注射后1小时。 “D 1”、“D 7”、“D 14”和“D 21”分别代表注射后1天、7天、14天和21天。 图42是示出用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理或未用rAAV处理的7月龄的Cyp21-/-小鼠 9 CN 111601620 A 说 明 书 7/37 页 的δ体重(变化)的图。在t0(注射)和w15(处理后15周)处测量体重。 图43示出了在处理后15周时用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的7月龄的Cyp21-/-小鼠 的肾上腺的HA-FITC免疫荧光图像。“TF”是指“经过处理的雌性”。“TM”是指“经过处理的雄 性”。所述图包含用于产生图像的小鼠的标识号。 图44示出了在处理后15周时用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的7月龄的Cyp21-/-小鼠 的肾上腺的CYP21-CY3免疫荧光图像。“TF”是指“经过处理的雌性”。“TM”是指“经过处理的 雄性”。所述图包含用于产生图像的小鼠的标识号。 图45示出了在处理后15周时用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的7月龄的Cyp21-/-小 鼠、未经处理的Cyp21-/-小鼠和Cyp21野生型( / )或Cyp21杂合( /-)小鼠的CYP21表达的蛋 白质印迹法的图像。用抗CYP21抗体(CorGen)检测CYP21。所述图包含用于产生数据的小鼠 的标识号。 图46A和图46B示出了用ssAAV10-CAG-CYP21HA(图46A)处理的7月龄的Cyp21-/-小 鼠和未经处理的Cyp21-/-小鼠(图46B)在15周内的尿孕酮水平(ng/mg肌酸酐)的测量结果。 图46C示出了用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的7月龄的野生型小鼠和未经处理的野生型小鼠 在15周内的尿孕酮水平(ng/mg肌酸酐)的测量结果。所述图包含用于产生数据的小鼠的标 识号。 图47示出了用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理或未用rAAV处理的2-3月龄的Cyp21-/-小 鼠的δ体重(变化)的图。在t0(注射)和w15(处理后15周)处测量体重。 图48描绘了带有处理后18周静脉内施用ssAAV10-CAG-CYP21HA的特定2-3月龄的 Cyp21-/-小鼠的肾上腺的病毒基因组拷贝(VGC)测量结果的表。所述表还包含注射rAAV时每 只小鼠中的对应尿孕酮水平(Prog W0)(ng/mg肌酸酐)、最低孕酮水平(最低Prog)和处理后 15周的孕酮水平(Prog W15)。图48还示出了经过处理的小鼠的肾上腺中CYP21HA表达的对 应免疫荧光图像。“TF”是指“经过处理的雌性”。“TM”是指“经过处理的雄性”。所述图包含用 于产生图像和数据的小鼠的标识号。 图49A和图49B示出了用ssAAV10-CAG-CYP21HA(图49A)处理的2-3月龄的Cyp21-/- 小鼠和未经处理的Cyp21-/-小鼠(图49B)在15周内的尿孕酮水平(ng/mg肌酸酐)的测量结 果。所述图包含用于产生数据的小鼠的标识号。 图50示出了在处理后1周用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的2-3月龄的Cyp21-/-小鼠 的肾上腺的CYP21HA免疫荧光图像。所述图包含用于产生图像的小鼠的标识号。 图51示出了在处理后3周用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的2-3月龄的Cyp21-/-小鼠 的肾上腺的CYP21HA免疫荧光图像。所述图包含用于产生图像的小鼠的标识号。 图52A-图52C示出了在向非人灵长类动物5号(NHP05)(重2.65kg的28月龄的雌性) 肾上腺内施用AAV1-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV1和AAV5 的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV6(1/5)筛查为阳性。图52A示出了在肾上腺的不同部 分(左侧和中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图52A还示 出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图52B示出了VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因(ARN) 测量结果的分布。图52C示出了右肾上腺的低(左侧)和高(右侧)放大率下的CYP21HA免疫荧 光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明载体的广泛表达。“RA”代表右肾上腺。“LA” 10 CN 111601620 A 说 明 书 8/37 页 代表左肾上腺。 图53A-图53C示出了在向非人灵长类动物8号(NHP08)(重2.35kg的28月龄的雌性) 静脉内施用AAV1-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV1和AAV6 的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV5(1/5)筛查为阳性。图53A示出了在肾上腺的不同部 分(左侧和中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图53A还示 出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图53B示出了VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因(ARN) 测量结果的分布。图53C示出了右肾上腺的低(左侧)和高(右侧)放大率下的CYP21HA免疫荧 光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明载体的低表达。“RA”代表右肾上腺。“LA”代 表左肾上腺。 图54A-图54C示出了在向非人灵长类动物6号(NHP06)(重2.8kg的28月龄的雌性) 肾上腺内施用AAV5-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV1(1/5)筛查为阳性。在rAAV施用前约两 周，所述动物对于AAV1和AAV5的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV6(1/5)筛查为阳性。图 54A示出了在肾上腺的不同部分(左侧和中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的 空间分布示意图。图54A还示出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图54B示出了VGC(左侧) 和mRNA相对于管家基因(ARN)测量结果的分布。图54C示出了右肾上腺的低(大图像)和高 (更小图像)放大率下的CYP21HA免疫荧光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明载体 的广泛表达。“RA”代表右肾上腺。“LA”代表左肾上腺。 图55A-图55C示出了在向非人灵长类动物9号(NHP09)(重2.5kg的28月龄的雌性) 肾上腺内施用AAV5-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV1、AAV5 和AAV6的中和抗体筛查为阴性。图55A示出了在肾上腺的不同部分(左侧和中心)中CYP21HA 载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图55A还示出了每个(右侧)肝叶的VGC 测量结果。图55B示出了VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因(ARN)测量结果的分布。图55C示 出了右肾上腺的低(中心)和高(左和右)放大率下的CYP21HA免疫荧光图像，其中CYP21HA阳 性细胞染色(绿色)表明载体的广泛表达。“RA”代表右肾上腺。“LA”代表左肾上腺。 图56A-图56C示出了在向非人灵长类动物7号(NHP07)(重2.85kg的28月龄的雌性) 肾上腺内施用AAV6-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV1(1/5)、 AAV5(1/5)和AAV6(1/5)的中和抗体筛查为阳性。图56A示出了在肾上腺的不同部分(左侧和 中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图56A还示出了每个 (右侧)肝叶的VGC测量结果。图56A还示出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图56B示出了 VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因(ARN)测量结果的分布。图56C示出了右肾上腺的低(左 侧)和高(右侧)放大率下的CYP21HA免疫荧光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明 载体的广泛表达。“RA”代表右肾上腺。“LA”代表左肾上腺。 图57A-图57C示出了在向非人灵长类动物10号(NHP10)(重2.35kg的28月龄的雌 性)肾上腺内施用AAV6-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对 于AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV5和 11 CN 111601620 A 说 明 书 9/37 页 AAV6的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV1(1/5)筛查为阳性。图57A示出了在肾上腺的不 同部分(左侧和中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图57A 还示出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图57B示出了VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因 (ARN)测量结果的分布。图57C示出了右肾上腺的低(左侧)和高(右侧)放大率下的CYP21HA 免疫荧光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明载体的最小表达。“RA”代表右肾上 腺。“LA”代表左肾上腺。 图58是总结了来自具有肾上腺内施用的rAAV载体的非人灵长类动物(NHP)的数据 的表。所列出的数据包含到右肾上腺(RA)或左肾上腺(LA)中的注射、载体同一性和每千克 剂量(kg)以及在分别给药的肾上腺中测量的所得载体基因组拷贝(VGC)。 图59示出了用AAV6-CAG-GFP处理的非人灵长类动物2号(NHP02)的左肾上腺的GFP 免疫荧光图像。 图60示出了在肾上腺内注射载体后，左肾上腺中的AAV6-CAG-GFP的GFP免疫荧光 图像。应用于腺体的剂量为6.0×1011vg。低(上图)和高(下图)放大率示出GFP阳性细胞的广 泛分布。右下方是示出单个细胞中GFP的细胞质定位的肾上腺皮质的一小部分的高倍放大 率×20(OBJX20)视图。细胞核被DAPI染色成蓝色。 图61示出了在肾上腺内(IA)或静脉内(IV)施用所指示的rAAV血清型后非人灵长 类动物(NHP)的肝脏的CYP21HA免疫荧光图像。白色箭头指示CYP21HA表达性细胞(绿色)。 图62总结了用重组血清型AAV5载体处理的非人灵长类动物(NHP)的给药和处理 组，所述重组血清型AAV5载体包含野生型(WT)人CYP21转基因、密码子优化的(CO)人CYP21 转基因或野生型食蟹猴CYP21转基因。所有载体包含CBA启动子和Kozak序列。含有人CYP21 转基因的载体进一步包含用于脱靶的miR-122miRNA结合位点。含有野生型人CYP21转基因 的载体被称为“AAV5-CBA-Kozak-hCYP21-miR122”。含有密码子优化的人CYP21转基因的载 体被称为“AAV5-CBA-Kozak-COhCYP21-miR122”。含有野生型食蟹猴CYP21转基因的载体被 称为“AAV5-CBA-Kozak-cynoCYP21”。 图63是示出图62和实例13中所描述的每个非人灵长类动物(NHP)处理组的CYP21 载体基因组拷贝(VGC)测量结果、mRNA测量结果和Sal-人与Sal-食蟹猴肽比率的表。对于 VGC和mRNA行，每一行的顶部数字是平均值，并且两个底部数字是平均值的范围。肽比率不 应被视为确切的蛋白与蛋白的比率。“h mRNA”是指人CYP21mRNA。“cyno mRNA”指食蟹猴 CYP21mRNA。指数数字的数字格式被解释为如以下实例所示：“1 .28.10-2”是指“1 .28×10 -2”。
本文所公开的是表达21‑羟化酶(21OH)蛋白的重组腺相关病毒载体以及用于治疗21OH缺乏症的相关用途。
背景技术：
21-羟化酶(21OH)是涉及类固醇激素醛固酮和皮质醇的生物合成的由CYP21A2基 因编码的细胞色素P450酶。这些合成发生在肾上腺皮质中。由基因转换而非点突变驱动的 功能性CYP21A2基因与密切相关的非功能性CYP21A1P假基因之间的高重组率导致了先天性 肾上腺增生(CAH)的高发病率和其不寻常的遗传学。CYP21A2的缺乏引起21-羟化酶缺乏症 (21OHD)，这导致以下两种情况中的任一种：i)胎儿外生殖器雄性化、低量产生或没有产生 糖皮质激素和盐皮质激素并且雄激素大量过量的CAH(“经典”21OHD)或ii)无胎儿雄性化、 无皮质醇和醛固酮缺乏但是雄激素的产生有所增加的更轻微形式的所述疾病(“非经典” 21OHD)。 在几十年的治疗性策略之后，对严重形式的21OHD的管理仍存在临床挑战性。当可 以用外源性类固醇治疗患者时，婴儿和成人患者仍存在肾上腺危象—婴儿和成人患者的肾 上腺无法对如常规感染、创伤或剧烈运动等身体应力作出响应—的风险。肾上腺危象甚至 在顺应疗法的受过良好教育的患者中也会快速导致严重休克和死亡。参见Hahner等人《, 临 床内分泌代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab)》,2月；100(2):407-416(2015)。另外，存在 与成长、性别和性征有关的显著后果。在女性患者中，使用超生理的糖皮质激素剂量抑制肾 上腺雄激素的产生存在一定的难度。因此，交替循环的雄激素与糖皮质激素过量会导致身 材矮小、肥胖症、儿童时期重复的生殖器手术、青春期的改变和长期男性化。对于患有因多 毛症、雄性肌肉发达、阴蒂增大和性征受损引起的经典和非经典形式的疾病的女性患者，雄 激素增多症仍然是主要美容负担。参见Gastaud等人《, 临床内分泌代谢杂志》,92(4) ,1391- 1396(2007)。男性患者存在身材矮小和过早男性化的风险。治疗失败甚至会导致一些患者 切除双侧肾上腺(Gmyrek等人《, 儿科(Pediatrics)》,109；E28(2002)；Bruining等人《, 临床 内分泌代谢杂志》,86,482-484(2001))。 仍然需要允许持续校正21OHD的疗法。 4 CN 111601620 A 说 明 书 2/37 页
技术实现要素：
本发明涵盖一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述rAAV载体包括核酸分子，所述 核酸分子包括至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)和对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编码的 非AAV核苷酸序列，所述非AAV核苷酸序列可操作地连接到启动子。 在某些情况下，rAAV载体对是人21OH蛋白的21OH蛋白进行编码。在一些实施例中， 对21OH蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列包括人21OH(CYP21A2)cDNA或由其组成。在某些实 施例中，对21OH蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列对SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列进行编码。 一种rAAV载体可以包括核酸分子，所述核酸分子包括至少一个AAV反向末端重复 序列(ITR)和对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列，所述非AAV核苷酸序列 可操作地连接到启动子，其中所述启动子引导所述21OH蛋白在宿主细胞(例如，肾上腺细胞 或肾上腺皮质细胞)中的表达。适合的启动子的非限制性实例包含巨细胞病毒/β-肌动蛋白 杂合启动子、PGK启动子或对肾上腺皮质细胞中的表达具有特异性的启动子。在一些实施例 中，巨细胞病毒/β-肌动蛋白杂合启动子是CAG、CB6或CBA启动子。在一些实施例中，启动子 包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的核苷酸序列或由其组成。 在一些方面，rAAV载体包括至少一个ITR序列。在某些实施例中，ITR是AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型ITR。 在某些情况下，本发明的rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74血清型。 本发明进一步提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述rAAV载体包括核酸分 子，所述核酸分子包括对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列，所述非AAV核 苷酸序列可操作地连接到启动子，其中所述rAAV载体包括至少一个AAV反向末端重复序列 (ITR)，其中所述ITR来自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、AAV11、AAV12、rh10或rh74的AAV；并且其中所述启动子是巨细胞病毒/β-肌动蛋白杂 合启动子、PGK启动子或对肾上腺皮质细胞中的表达具有特异性的启动子。在一些实施例 中，巨细胞病毒/β-肌动蛋白杂合启动子是CAG、CB6或CBA启动子。 在一些方面，本发明涵盖一种rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包括本文所述的rAAV载体。 在一些实施例中，rAAV颗粒进一步包括至少一种衣壳蛋白，所述至少一种衣壳蛋白来自AAV 血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10或 rh74。 本发明还涵盖一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所述的rAAV载体或rAAV 颗粒以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。另外，本发明设想了一种生产rAAV颗粒的 方法，所述方法包括培养宿主细胞，所述宿主细胞含有：(a)本文所述的rAAV载体；(b)对 AAVrep进行编码的核酸分子；(c)对至少一种AAV衣壳蛋白进行编码的核酸分子；以及(d)用 于包装所述rAAV颗粒的充分辅助功能。 在某些情况下，本发明提供了一种在有需要的受试者体内表达21-羟化酶(21OH) 的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的rAAV颗粒或包括此类rAAV颗粒的药 物组合物，从而在所述受试者体内表达21OH，所述rAAV颗粒包括rAAV载体，所述rAAV载体包 括核酸分子，所述核酸分子包括至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)和对21-羟化酶 5 CN 111601620 A 说 明 书 3/37 页 (21OH)蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列，所述非AAV核苷酸序列可操作地连接到启动子。 在一些情况下，可以在所述受试者的肾上腺皮质、肾上腺髓质、肾上腺干细胞、肾上腺祖细 胞、肝脏或卵巢中表达21OH。 本发明进一步提供了一种治疗患有21-羟化酶缺乏症(21OHD)的受试者的方法，所 述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的rAAV颗粒或包括此类rAAV颗粒的药物组合物， 从而治疗所述受试者的21OHD，所述rAAV颗粒包括rAAV载体，所述rAAV载体包括核酸分子， 所述核酸分子包括至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)和对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编 码的非AAV核苷酸序列，所述非AAV核苷酸序列可操作地连接到启动子。此方法可以进一步 包括在施用步骤之前选择患有21OHD的受试者。 在一些情况下，静脉内、通过经由开放性手术或腹腔镜检查直接注入肾上腺中或 通过经由导管插入注入肾上腺动脉中向所述受试者施用rAAV载体或rAAV颗粒或包括此类 rAAV载体或rAAV颗粒的药物组合物。直接注入肾上腺中可以是直接注入所述肾上腺皮质 中。 通过本发明的方法或组合物治疗的受试者可能患有21OHD的普拉德IV期或V期类 型。在一些情况下，受试者患有先天性肾上腺增生(CAH)。 本发明还设想了一种rAAV载体或包括此类载体的rAAV颗粒的用途，其用于制造用 于治疗21-羟化酶缺乏症的药物，所述rAAV载体包括核酸分子，所述核酸分子包括至少一个 AAV反向末端重复序列(ITR)和对21-羟化酶(21OH)蛋白进行编码的非AAV核苷酸序列，所述 非AAV核苷酸序列可操作地连接到启动子。 附图说明 图1A-图1C示出了注射有CYP21载体(灰色，n＝16)或假载体(黑色，n＝9)的 Cyp21-/-小鼠与被视为“对照”小鼠(白色，n＝21)的Cyp21 /-和Cyp21 / 相比的体重和尿孕酮 的演进。图1A是示出注射有假载体的Cyp21-/-小鼠始终保持比对照小鼠更小的条形图(P< 0.001)。注射有CYP21载体的小鼠在注射后5周和10周(P<0.001)以及注射后15周(P<0.01) 体重显著恢复。图1B示出了在载体注射前和杀死时注射有假载体(左)或CYP21载体(中)的 Cyp21-/-小鼠和对照小鼠(右)的照片。图1C是示出注射有假载体的Cyp21-/-小鼠与对照小鼠 (P<0.001)相比始终具有高得多的尿孕酮浓度的条形图。用CYP21载体进行的基因疗法诱导 尿孕酮大量减少。然而，校正并不完整。与对照小鼠相比，经CYP21处理的Cyp21-/-小鼠的孕 酮水平仍然大约高两倍(注射后5周时P<0.001，注射后10周时无显著性，并且注射后15周时 P<0.05)。数据呈现为平均值±平均数标准误差(s.e.m.)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 图2A-图2F是示出注射有CYP21载体(灰色，n＝14)或假载体(黑色，n＝13)的 Cyp21-/-小鼠与对照(白色，n＝19)相比的运动和应激应答的研究结果的条形图。图2A示出 注射有CYP21或假载体的Cyp21-/-小鼠和对照小鼠具有如通过转棒评估的相当的运动表现。 图2B示出注射有假载体的Cyp21-/-小鼠在悬尾测试中与对照小鼠相比更不移动(对照与假 载体小鼠之间的P＝0.21)。用CYP21载体处理的Cyp21-/-小鼠恢复了对测试的正常应答(对 照与CYP21载体小鼠之间的P<0.05)。图2C-2F示出与高架十字迷宫测试(elevated plus- mazetest)中注射有CYP21载体的Cyp21-/-小鼠和对照小鼠相比，注射有假载体的Cyp21-/-小 鼠行进了更小的距离(对照与假载体小鼠之间的P<0.001)(图2C)，在开放臂中花费的时间 6 CN 111601620 A 说 明 书 4/37 页 更少(对照与假载体小鼠之间无显著性)(图2D)，进行了更少探头次数(head-dipping)(对 照与假载体小鼠之间的P<0.05)(图2E)和后腿站立移动(对照与假载体小鼠之间的P<0.01) (图2F)。对于所有高架十字迷宫参数，对照与CYP21载体之间的差异不显著。数据呈现为平 均值±平均数标准误差。*P<0.05，***P<0.001。 图3A和图3B是示出注射有CYP21载体(灰色，n＝11)或假载体(黑色，n＝8)的 Cyp21-/-小鼠与对照小鼠(白色，n＝16)相比的肾上腺和肾脏中的基因表达的研究结果的条 形图。图3A示出CYP21注射的小鼠的肾上腺相比于针对ACTH受体(Mc2r)、蛋白激酶A调节亚 单位(Prkar2a)、类固醇生成因子1(SF-1)(P<0.01)、类固醇生成急性调节蛋白(Star)和类 固醇生成酶Cyp17a1和Cyp11b2(P<0.05)的mRNA含量。CYP21注射的小鼠的mRNA含量与对照 相比仍有所增加，即使对于SF-1、Star、Hsd3b1(P<0.05)、Prkar1a、Cyp11b1(P<0.01)、Mc2r、 Prkar2a和Cyp11b2(P<0.001)的水平较低，并且对于Prkarca、Prkarcb、Cyp11a1和Cyp17a1 的水平则没有变化。图3B示出CYP21注射的小鼠相对于假载体的肾脏中的肾素mRNA含量降 低(P<0.001)，尽管当将CYP21注射的小鼠与对照相比时，所述肾素mRNA含量仍有所增加(P< 0 .001)。数据相对于Tbp归一化，并且呈现为平均值±平均数标准误差。*P<0 .05，**P< 0.01，***P<0.001。 图4A和图4B示出了用pCYP21(n＝3，灰色)或pLuc(n＝3，黑色)转染的Y1细胞中21- 羟化酶表达和孕酮浓度的分析结果。图4A示出用pCYP21转染的Y1细胞与用pLuc转染的Y1细 胞相比如通过蛋白质印迹评估的表达21-羟化酶。图4B示出用pCYP21转染的Y1细胞在上清 液中的孕酮浓度低于用pLuc转染的Y1细胞(P＝0.10)。数据呈现为平均值±平均数标准误 差。 图5A和图5B示出静脉内注射AAVrh10引起肾上腺皮质中的转基因表达。图5A是示 出在对照小鼠中静脉内注射后肾上腺中AAVrh10的GFP荧光图案的图像。图5B是示出用 CYP21载体处理的对照和Cyp21-/-小鼠的肾上腺中小鼠和人21-羟化酶表达的免疫印迹。 图6示出了对照小鼠和注射有假载体或CYP21载体的Cyp21-/-小鼠的肾上腺冷冻切 片的组织学分析图像。顶部，比例尺＝500μm；底部，比例尺＝200μm。 图7示出了对照小鼠和注射有假载体或CYP21载体的Cyp21-/-小鼠的肾上腺中的醛 固酮合酶表达的图像。 图8A和图8B示出了静脉内注射有AAVrh10-CAG-GFP的对照小鼠外围器官中的GFP 表达的图像。图8A示出了心脏。图8B示出了肝脏。 图9示出了在左肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-GFP的非人灵长类动物1号(NHP01)的 肾上腺的GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(未经注射)和左侧(经过注射)肾 上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图10示出了注射有ssAAV5-PGK-GFP的非人灵长类动物1号(NHP01)的左肾上腺的 GFP免疫荧光图像。 图11示出了注射有ssAAV5-PGK-GFP的非人灵长类动物1号(NHP01)的左肾上腺的 整个切片的GFP免疫荧光图像。 图12示出了在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物1号 (NHP01)的肾上腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(经过注射)和左 侧(未经注射)肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 7 CN 111601620 A 说 明 书 5/37 页 图13示出了注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物1号(NHP01)的右肾上 腺的HA免疫荧光图像。 图14示出了在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物2号 (NHP02)的肾上腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(经过注射)和左 侧(未经注射)肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 在右肾上腺中，向此动物以三次注射的方式施用4.5×1011vg。此值比施用NHP01的值低6.6 倍。 图15示出了注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物2号(NHP02)的右肾上 腺中的HA免疫荧光图像。在右肾上腺中，向此动物以三次注射的方式施用4.5×1011vg。此值 比施用NHP01的值低6.6倍。 图16示出了在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物4号 (NHP04)的肾上腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(经过注射)和左 侧(未经注射)肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图17示出了在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA后，非人灵长类动物4号 (NHP04)的右肾上腺的解剖细节的示意图和照片。 图18示出了来自在右肾上腺中注射有ssAAV5-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物4号 (NHP04)的切成小片的肾上腺中的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果空间分布的示意 图。推定的注射部位用黑色箭头指示。 图19示出了在手术结束(ES)时和安乐死(Eu)后，在NHP01和NHP02的肝脏中 ssAAV5-PGK-CYP21HA的平均CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。图19还示出了注射有 ssAAV5-PGK-CYP21HA的NHP01、NHP02和NHP04的肝脏的HA免疫荧光图像。 图20示出了静脉内施用ssAAV5-PGK-GFP的野生型小鼠的肾上腺的GFP病毒基因组 拷贝(VGC)测量结果。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。图20还示出了静 脉内用ssAAV5-PGK-GFP处理的野生型小鼠的肾上腺的免疫荧光图像。 图21示出了静脉内施用ssAAV5-PGK-CYP21HA的野生型小鼠的肾上腺的CYP21HA病 毒基因组拷贝(VGC)测量结果。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图22示出了在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物2号(NHP02) 的肾上腺的GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(未经注射)和左侧(经过注射) 肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图23示出了注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物2号(NHP02)的左肾上腺的 GFP免疫荧光图像。 图24示出了在注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物2号(NHP02)的左肾上腺 中的所选阳性GFP免疫荧光图像。“OBJX20”是指放大率×20。 图25示出了注射有ssAAV6-CAG-GFP的NHP02的左肾上腺的GFP免疫荧光图像。此图 示出了免疫荧光信号在肾上腺各片上的不等分布。 图26示出了在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物4号(NHP04) 的肾上腺的GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(未经注射)和左侧(经过注射) 肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图27示出了在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP后，非人灵长类动物4号(NHP04) 8 CN 111601620 A 说 明 书 6/37 页 的左肾上腺的解剖细节的示意图和照片。 图28示出了来自在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的非人灵长类动物4号 (NHP04)的切成小片的两个肾上腺中的GFP VGC测量结果空间分布的分布。 图29示出了在手术结束(ES)时和安乐死(Eu)后，在注射有ssAAV6-CAG-GFP的 NHP02和NHP04的肝脏中的平均GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。图29还示出了在左肾上 腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的NHP04的肝脏的GFP免疫荧光图像。 图30示出了在左肾上腺中注射有ssAAV6-CAG-GFP的NHP04的肝脏的另一个GFP免 疫荧光图像。 图31示出了静脉内施用ssAAV6-CAG-GFP的野生型小鼠的肾上腺的GFP病毒基因组 拷贝(VGC)测量结果。图31还示出了静脉内用ssAAV6-CAG-GFP处理的野生型小鼠的肾上腺 的GFP免疫荧光图像。 图32示出了通过IP(腹膜内)注射或IH(肝内)注射用ssAAV6-CAG-GFP处理的野生 型小鼠肾上腺的GFP免疫荧光图像。 图33示出了在左肾上腺中注射有ssAAV1-CB6-GFP的非人灵长类动物3号(NHP03) 的肾上腺的GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(未经注射)和左侧(经过注射) 肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图34示出了注射有ssAAV1-CB6-GFP的非人灵长类动物3号(NHP03)的左肾上腺的 GFP免疫荧光图像。 图35示出了在手术结束(ES)时和安乐死(Eu)后，NHP03的肝脏中ssAAV1-CB6-GFP 的平均GFP病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。图35还示出了在左肾上腺中注射有ssAAV1- CB6-GFP的NHP03的肝脏的GFP免疫荧光图像。 图36示出了静脉内施用ssAAV1-CB6-GFP的野生型小鼠的肾上腺的GFP病毒基因组 拷贝(VGC)测量结果。图36还示出了静脉内用ssAAV1-CB6-GFP处理的野生型小鼠的肾上腺 的GFP免疫荧光图像。 图37示出了在右肾上腺中注射有ssAAV1-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物3号 (NHP03)的肾上腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。示出了右侧(经过注射)和左 侧(未经注射)肾上腺两者的VGC计数。星号表明在实例1-6中有效处理Cyp21-/-小鼠的VGC。 图38示出了注射有ssAAV1-PGK-CYP21HA的非人灵长类动物3号(NHP03)的右肾上 腺的HA免疫荧光图像。在右肾上腺中，向动物以两次注射的方式施用2.2×1012。 图39示出了在手术结束(ES)时和安乐死(Eu)后，在右肾上腺中注射有ssAAV1- PGK-CYP21HA的NHP03的肝脏中的CYP21HA平均病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。图39还示出 了在右肾上腺中注射有ssAAV1-PGK-CYP21HA的NHP03的肝脏的HA免疫荧光图像。 图40示出了静脉内施用1×1014vg/kg ssAAV1-PGK-CYP21HA的野生型小鼠的肾上 腺的CYP21HA病毒基因组拷贝(VGC)测量结果。 图41A和图41B示出了总结在不同时间点在NHP01、NHP02、NHP03和NHP04中的GFP (图41A)和hCYP21HA(图41B)的血液VGC的测量结果的线形图。图41C示出了总结手术结束时 作为肾上腺内注射剂量的函数的血液VGC的图。vg＝病毒基因组。“H 1”代表注射后1小时。 “D 1”、“D 7”、“D 14”和“D 21”分别代表注射后1天、7天、14天和21天。 图42是示出用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理或未用rAAV处理的7月龄的Cyp21-/-小鼠 9 CN 111601620 A 说 明 书 7/37 页 的δ体重(变化)的图。在t0(注射)和w15(处理后15周)处测量体重。 图43示出了在处理后15周时用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的7月龄的Cyp21-/-小鼠 的肾上腺的HA-FITC免疫荧光图像。“TF”是指“经过处理的雌性”。“TM”是指“经过处理的雄 性”。所述图包含用于产生图像的小鼠的标识号。 图44示出了在处理后15周时用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的7月龄的Cyp21-/-小鼠 的肾上腺的CYP21-CY3免疫荧光图像。“TF”是指“经过处理的雌性”。“TM”是指“经过处理的 雄性”。所述图包含用于产生图像的小鼠的标识号。 图45示出了在处理后15周时用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的7月龄的Cyp21-/-小 鼠、未经处理的Cyp21-/-小鼠和Cyp21野生型( / )或Cyp21杂合( /-)小鼠的CYP21表达的蛋 白质印迹法的图像。用抗CYP21抗体(CorGen)检测CYP21。所述图包含用于产生数据的小鼠 的标识号。 图46A和图46B示出了用ssAAV10-CAG-CYP21HA(图46A)处理的7月龄的Cyp21-/-小 鼠和未经处理的Cyp21-/-小鼠(图46B)在15周内的尿孕酮水平(ng/mg肌酸酐)的测量结果。 图46C示出了用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的7月龄的野生型小鼠和未经处理的野生型小鼠 在15周内的尿孕酮水平(ng/mg肌酸酐)的测量结果。所述图包含用于产生数据的小鼠的标 识号。 图47示出了用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理或未用rAAV处理的2-3月龄的Cyp21-/-小 鼠的δ体重(变化)的图。在t0(注射)和w15(处理后15周)处测量体重。 图48描绘了带有处理后18周静脉内施用ssAAV10-CAG-CYP21HA的特定2-3月龄的 Cyp21-/-小鼠的肾上腺的病毒基因组拷贝(VGC)测量结果的表。所述表还包含注射rAAV时每 只小鼠中的对应尿孕酮水平(Prog W0)(ng/mg肌酸酐)、最低孕酮水平(最低Prog)和处理后 15周的孕酮水平(Prog W15)。图48还示出了经过处理的小鼠的肾上腺中CYP21HA表达的对 应免疫荧光图像。“TF”是指“经过处理的雌性”。“TM”是指“经过处理的雄性”。所述图包含用 于产生图像和数据的小鼠的标识号。 图49A和图49B示出了用ssAAV10-CAG-CYP21HA(图49A)处理的2-3月龄的Cyp21-/- 小鼠和未经处理的Cyp21-/-小鼠(图49B)在15周内的尿孕酮水平(ng/mg肌酸酐)的测量结 果。所述图包含用于产生数据的小鼠的标识号。 图50示出了在处理后1周用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的2-3月龄的Cyp21-/-小鼠 的肾上腺的CYP21HA免疫荧光图像。所述图包含用于产生图像的小鼠的标识号。 图51示出了在处理后3周用ssAAV10-CAG-CYP21HA处理的2-3月龄的Cyp21-/-小鼠 的肾上腺的CYP21HA免疫荧光图像。所述图包含用于产生图像的小鼠的标识号。 图52A-图52C示出了在向非人灵长类动物5号(NHP05)(重2.65kg的28月龄的雌性) 肾上腺内施用AAV1-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV1和AAV5 的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV6(1/5)筛查为阳性。图52A示出了在肾上腺的不同部 分(左侧和中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图52A还示 出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图52B示出了VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因(ARN) 测量结果的分布。图52C示出了右肾上腺的低(左侧)和高(右侧)放大率下的CYP21HA免疫荧 光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明载体的广泛表达。“RA”代表右肾上腺。“LA” 10 CN 111601620 A 说 明 书 8/37 页 代表左肾上腺。 图53A-图53C示出了在向非人灵长类动物8号(NHP08)(重2.35kg的28月龄的雌性) 静脉内施用AAV1-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV1和AAV6 的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV5(1/5)筛查为阳性。图53A示出了在肾上腺的不同部 分(左侧和中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图53A还示 出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图53B示出了VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因(ARN) 测量结果的分布。图53C示出了右肾上腺的低(左侧)和高(右侧)放大率下的CYP21HA免疫荧 光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明载体的低表达。“RA”代表右肾上腺。“LA”代 表左肾上腺。 图54A-图54C示出了在向非人灵长类动物6号(NHP06)(重2.8kg的28月龄的雌性) 肾上腺内施用AAV5-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV1(1/5)筛查为阳性。在rAAV施用前约两 周，所述动物对于AAV1和AAV5的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV6(1/5)筛查为阳性。图 54A示出了在肾上腺的不同部分(左侧和中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的 空间分布示意图。图54A还示出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图54B示出了VGC(左侧) 和mRNA相对于管家基因(ARN)测量结果的分布。图54C示出了右肾上腺的低(大图像)和高 (更小图像)放大率下的CYP21HA免疫荧光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明载体 的广泛表达。“RA”代表右肾上腺。“LA”代表左肾上腺。 图55A-图55C示出了在向非人灵长类动物9号(NHP09)(重2.5kg的28月龄的雌性) 肾上腺内施用AAV5-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV1、AAV5 和AAV6的中和抗体筛查为阴性。图55A示出了在肾上腺的不同部分(左侧和中心)中CYP21HA 载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图55A还示出了每个(右侧)肝叶的VGC 测量结果。图55B示出了VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因(ARN)测量结果的分布。图55C示 出了右肾上腺的低(中心)和高(左和右)放大率下的CYP21HA免疫荧光图像，其中CYP21HA阳 性细胞染色(绿色)表明载体的广泛表达。“RA”代表右肾上腺。“LA”代表左肾上腺。 图56A-图56C示出了在向非人灵长类动物7号(NHP07)(重2.85kg的28月龄的雌性) 肾上腺内施用AAV6-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对于 AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV1(1/5)、 AAV5(1/5)和AAV6(1/5)的中和抗体筛查为阳性。图56A示出了在肾上腺的不同部分(左侧和 中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图56A还示出了每个 (右侧)肝叶的VGC测量结果。图56A还示出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图56B示出了 VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因(ARN)测量结果的分布。图56C示出了右肾上腺的低(左 侧)和高(右侧)放大率下的CYP21HA免疫荧光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明 载体的广泛表达。“RA”代表右肾上腺。“LA”代表左肾上腺。 图57A-图57C示出了在向非人灵长类动物10号(NHP10)(重2.35kg的28月龄的雌 性)肾上腺内施用AAV6-CAG-hCYP21HA后获得的结果。在rAAV施用前约两个月，所述动物对 于AAV1、AAV5和AAV6的中和抗体筛查为阴性。在rAAV施用前约两周，所述动物对于AAV5和 11 CN 111601620 A 说 明 书 9/37 页 AAV6的中和抗体筛查为阴性，并且对于AAV1(1/5)筛查为阳性。图57A示出了在肾上腺的不 同部分(左侧和中心)中CYP21HA载体基因组拷贝(VGC)测量结果的空间分布示意图。图57A 还示出了每个(右侧)肝叶的VGC测量结果。图57B示出了VGC(左侧)和mRNA相对于管家基因 (ARN)测量结果的分布。图57C示出了右肾上腺的低(左侧)和高(右侧)放大率下的CYP21HA 免疫荧光图像，其中CYP21HA阳性细胞染色(绿色)表明载体的最小表达。“RA”代表右肾上 腺。“LA”代表左肾上腺。 图58是总结了来自具有肾上腺内施用的rAAV载体的非人灵长类动物(NHP)的数据 的表。所列出的数据包含到右肾上腺(RA)或左肾上腺(LA)中的注射、载体同一性和每千克 剂量(kg)以及在分别给药的肾上腺中测量的所得载体基因组拷贝(VGC)。 图59示出了用AAV6-CAG-GFP处理的非人灵长类动物2号(NHP02)的左肾上腺的GFP 免疫荧光图像。 图60示出了在肾上腺内注射载体后，左肾上腺中的AAV6-CAG-GFP的GFP免疫荧光 图像。应用于腺体的剂量为6.0×1011vg。低(上图)和高(下图)放大率示出GFP阳性细胞的广 泛分布。右下方是示出单个细胞中GFP的细胞质定位的肾上腺皮质的一小部分的高倍放大 率×20(OBJX20)视图。细胞核被DAPI染色成蓝色。 图61示出了在肾上腺内(IA)或静脉内(IV)施用所指示的rAAV血清型后非人灵长 类动物(NHP)的肝脏的CYP21HA免疫荧光图像。白色箭头指示CYP21HA表达性细胞(绿色)。 图62总结了用重组血清型AAV5载体处理的非人灵长类动物(NHP)的给药和处理 组，所述重组血清型AAV5载体包含野生型(WT)人CYP21转基因、密码子优化的(CO)人CYP21 转基因或野生型食蟹猴CYP21转基因。所有载体包含CBA启动子和Kozak序列。含有人CYP21 转基因的载体进一步包含用于脱靶的miR-122miRNA结合位点。含有野生型人CYP21转基因 的载体被称为“AAV5-CBA-Kozak-hCYP21-miR122”。含有密码子优化的人CYP21转基因的载 体被称为“AAV5-CBA-Kozak-COhCYP21-miR122”。含有野生型食蟹猴CYP21转基因的载体被 称为“AAV5-CBA-Kozak-cynoCYP21”。 图63是示出图62和实例13中所描述的每个非人灵长类动物(NHP)处理组的CYP21 载体基因组拷贝(VGC)测量结果、mRNA测量结果和Sal-人与Sal-食蟹猴肽比率的表。对于 VGC和mRNA行，每一行的顶部数字是平均值，并且两个底部数字是平均值的范围。肽比率不 应被视为确切的蛋白与蛋白的比率。“h mRNA”是指人CYP21mRNA。“cyno mRNA”指食蟹猴 CYP21mRNA。指数数字的数字格式被解释为如以下实例所示：“1 .28.10-2”是指“1 .28×10 -2”。
