技术摘要：
双报告基因骨架载体，包括双报告基因骨架载体，其双报告基因选自荧光素酶和荧光蛋白，荧光蛋白报告基因优选mGFP基因，荧光素酶报告基因优选Fluc基因；双报告基因四质粒假病毒包装系统包括双报告基因骨架载体以及分别整合慢病毒gag‑pol基因、慢病毒rev基因以及含有目的 全部
背景技术：
冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(order Nidovirals)、 冠状病毒科(family Coronavirade)、冠状病毒属(genus Coronavirus)的成员，基因组为 单股、正链的RNA，基因组全长在26～32kb之 间，是目前已知基因组最大的RNA病毒。冠状病 毒在自然界的感染普非常广泛， 常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以及家禽类都易感。 近几年来，又从 白鲸、骆驼，尤其是蝙蝠体内分离到多种类型的冠状病毒。人冠状病毒目前 已 知有六种，分别是二十世纪60年代发现的人冠状病229E(HCoV-229E)和 HCoV-OC43， 2003年出现的SARS，2004年在荷兰分离的HCoV-NL63，2005年在 香港鉴定的HCoV-HKU1以及 2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征 (Middle East respiratory syndrome virus，MERS)冠状病毒MERS-CoV。 SARS-CoV-2与SARS(severe acute respiratory syndrome)的基因具有高度 的同源性。在2019-nCoV侵染宿主细胞过程中，病毒的刺突蛋白 (spike protein,S protein)首先识别细胞膜上受体蛋白ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2)，进而介导并促使病毒包膜与细胞膜发 生融合，最终使病毒侵入宿主细胞。冠状 病毒能够感染机体的呼吸道、消化道、 肝脏、肾脏以及神经系统，造成不同程度的病理性损 伤，严重者甚至造成死亡。 自新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎疫情暴发以来，截至目前已引起全国 超过8万 人被感染，3000多人死亡；而在全球范围内已导致超过200000人感 染，是一种传播性很强 的病毒。SARS-CoV-2冠状病毒与传统冠状病毒的区别在 于对所有人都易感，既能感染上呼 吸道，引起发热、咳嗽、喉炎等普通感冒症 状，又能感染下呼吸道，引起支气管炎、肺炎等急 性呼吸道症状。SARS-CoV-2 与SARS冠状病毒的结构相似，是一种有包膜的单股正链RNA病 毒，体现在病毒 表面的刺突蛋白S蛋白是病毒包膜上特异性的组织结构，在病毒的表面形 成了 大量的刺突蛋白，在病毒入侵靶细胞以及病毒与细胞识别时发挥着重要作用， 同时 SARS-CoV-2通过气溶胶传播，已有的研究表明其传播能力是SARS的十倍 以上。因此在非P3 实验室操作SARS-CoV-2活病毒具有极大的生物安全隐患。 假病毒是指一种反转录病毒能够整合另外一种不同种类病毒的囊膜糖蛋 白，形 成的具有外源性病毒的囊膜，而基因组保持着反转录病毒本身基因组特 性的病毒。假病毒 由于核酸分子的缺陷性而只有一个细胞感染周期，因此具有 较高生物安全性，这对研究具 有致病率高，传染性强、不易在体外培养的病毒 如HIV、SARS等提供了一种安全有效的研究 方法。体外构建的假病毒还具有稳 定性强、宿主嗜性广等优点，因此被广泛应用于病毒宿 主细胞的筛选、疫苗的 研发、中和抗原表位研究等方面。 目前有关SARS-CoV-2的基础研究较为薄弱，流行病学调查较少，而这些研 究普遍 4 CN 111593073 A 说 明 书 2/8 页 需要操作SARS-CoV-2活病毒，而操作SARS-CoV-2活病毒具有较强的生 物安全隐患，因此包 装制备出生物安全性等级较低的SARS-CoV-2的假病毒具有 重要意义。
技术实现要素：
双报告基因骨架载体，包括选自慢病毒遗传物质的双报告基因骨架载体， 所述双 报告基因骨架载体的双报告基因选自荧光素酶和荧光蛋白，荧光素酶报 告基因的上游是 调节转录的启动子,其中所述启动子优选自hEF1a启动子；所述 荧光蛋白报告基因的上游 是增强型转录启动子E-IRES；所述双报告基因骨架载 体命名为pDLV19-mGFP-Fluc。 进一步的，所述双报告基因包括荧光蛋白报告基因和荧光素酶报告基因， 所述的 荧光蛋白报告基因选自绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白；所述荧光素酶报 告基因选自萤火 虫荧光素酶或海肾荧光素酶。 进一步的，所述荧光蛋白报告基因选择修饰的绿色荧光蛋白mGFP基因，所 述绿色 荧光蛋白mGFP基因的序列为SEQ ID NO：1；所述荧光素酶报告基因选 自密码子优化的萤火 虫荧光素酶Fluc基因，所述萤火虫荧光素酶Fluc基因的 序列为SEQ ID NO：2。 进一步的，所述萤火虫荧光素酶Fluc基因的上游是hEF1a启动子，所述 hEF1a启动 子基因序列为SEQ ID NO：3，所述绿色荧光蛋白mGFP基因的上游是 ECMV-IRES增强启动子， 所述ECMV-IRES增强启动子的基因序列为SEQ ID NO： 4。 进一步的，所述绿色荧光蛋白mGFP基因位于荧光素酶Fluc基因的下游， 所述绿色 荧光蛋白mGFP基因起始密码子序列之前添加了Kozak序列。 进一步的，所述pDLV19-mGFP-Fluc双报告基因骨架载体具有SEQ ID NO： 5的序 列。 一种四质粒假病毒包装系统，由权利要求1～6中任一双报告基因骨架载体 pDLV19-mGFP-Fluc、3种真核表达包装质粒组成；其中所述3种真核表达包装 质粒分别整合 慢病毒gag-pol基因、慢病毒rev基因以及含有目的病毒的包膜 蛋白基因。 进一步的，所述3种真核表达包装质粒选自pCAGGS，质粒pCAGGS中CMV 启动子的序 列优选替换为： (3)EF1a启动子； (4)包含有人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因增强型启动子。 进一步的，所述含有慢病毒gag-pol的真核表达包装质粒具有SEQ ID NO： 6序列， 所述包装质粒命名为psl4-gag-pol；所述含有慢病毒rev基因的真核 表达包装质粒具有 SEQ ID NO：7序列，所述包装质粒命名为psl5-rev。 进一步的，所述pCAGGS真核表达包装质粒在宿主细胞水平表达目的病毒的 包膜 蛋白，所述pCAGGS真核表达包装质粒细胞水平表达的包膜蛋白选自冠状病 毒、疱疹病毒、 痘病毒、嗜肝病毒、丝状病毒、棒状病毒、流感病毒、副粘病 毒、黄病毒、弹状病毒、副粘病 毒、黄病毒、包膜病毒、布尼亚病毒或逆转录 病毒的一种病毒或多种病毒。 进一步的，所述冠状病毒优选为SARS-CoV-2或SARS；所述嗜肝病毒优选 为乙肝病 毒或丙肝病毒；所述丝状病毒优选为Ebola病毒；所述弹状病毒优选 为狂犬病毒；所述副粘 病毒优选为麻疹病毒或呼吸道合胞病毒；所述黄病毒优 选为寨卡病毒或登革热病毒。 进一步的，所述真核表达包装质粒表达的包膜蛋白选自冠状病毒 SARS-CoV-2，所 5 CN 111593073 A 说 明 书 3/8 页 述双报告基因四质粒假病毒包装系统用于制备新冠假病毒时， 所述冠状病毒包膜蛋白选 自：(1)刺突蛋白S全长氨基酸，即SEQ ID NO：8序 列、(2)刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基 酸，即SEQ ID NO：9序列、(3)刺 突蛋白S的3’端缺失28个氨基酸，即SEQ ID NO：10序列或 (4)刺突蛋白S 的3’端缺失53个氨基酸且同时融合VSV包膜蛋白的胞内段，即SEQ ID NO： 11序列；对应的所述pCAGGS真核表达包装质粒在宿主细胞水平表达的囊膜蛋 白的质粒命 名分别为psl3-S、S19、S28、S53C。 一种包装新冠肺炎假病毒，其特征在于：包括权利要求7～12任一所述双 报告基 因四质粒假病毒包装系统、宿主细胞，所述宿主细胞选自293、293T、 293sus、HEK293、 HEK293T或HEK293FT细胞，所述宿主细胞表面稳定表达hACE2 蛋白。 需要补充说明内容如下： 本发明专利涉及到的假病毒优先考虑有包膜病毒的假病毒； 新冠假病毒的制备方法，其包括以下步骤：将权利要求1-6任一项的双报 告基因 载体，和两个包装辅助质粒，以及包膜蛋白真核表达载体，合计4个质 粒共转染293T- hACE2，收集细胞培养上清，获得假病毒；其中，所述包膜表达 载体含有新冠病毒的包膜蛋 白S基因及其改造体，所述的293T-hACE2是通过慢 病毒将hACE2整合到宿主细胞基因组中， 所述的293T-hACE2宿主细胞膜表面稳 定表达hACE2蛋白，所述的hACE2是冠状病毒SARS- CoV-2进入哺乳动物细胞的 主要受体。 附图说明： 图1、hEF1α启动子启动Luc表达和IRES下的EGFP蛋白双报告检测体系(A)； 四个目 的基因PCR扩增出条带(B)； 图2、建立四种包膜假病毒包装系统(图2A)，验证三种包膜变构体包装新冠 假病 毒的效率(图2B)； 图3、启动子及报告基因优化的pDLV19-mGFP-Fluc质粒系统与传统未优化的 进行 假病毒(VSVG囊膜)包装及体外复感染检测GFP的表达(A)和Luc(B) 的表达强度； 图4、四质粒体系包装出的新冠假病毒模拟SARS-CoV-2,应用于阳性血清的中 和 抗体的检测； 如下
