技术摘要：
本发明公开了对GPX4或其片段为反应性的抗体或者GPX4基因在制备用于预测红斑狼疮疾病活动度的药物中的用途。狼疮患者中性粒细胞的GPX4蛋白含量低于健康人，这种含量降低与疾病活动度有关，疾病活动度越高，下降程度越严重。在有效的临床治疗后，GPX4的含量也随之上升。G 全部
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)是一种严重的疾病，涉及免疫系统失调，致病性自身抗体过 量产生(及其在血清中的上调)以及多种免疫系统介导的损伤。自1982年以来，抗双链(ds) DNA抗体已成为SLE的一些经典诊断和病原学标准。抗dsDNA抗体具有不同的亚类，包括IgA， IgE，IgG和IgM。尽管如此，并非所有这些都同样对SLE的组织损伤做出了贡献。与人类疾病 活动相关的是IgG和IgA，而不是IgM。通常，核抗原，例如dsDNA，是免疫系统无法接近的，因 为它们局限于细胞核和线粒体，并被细胞质和内体中的DNase迅速降解。但是，暴露于紫外 线，感染和药物后，核材料可以从凋亡细胞中释放出来。细胞通过不同的过程经历死亡。 NETosis期间，细胞会挤出DNA和嗜中性粒细胞胞外陷阱(NETs)，其中的DNA被抗菌物质覆 盖。在细胞凋亡中，DNA裂解导致凋亡小体的形成，其中包含与DNA结合的微粒。在坏死中，细 胞裂解后释放出高分子量的DNA。释放的DNA可被抗DNA抗体识别并组成免疫复合物。未成熟 的树突状细胞(iDC)可以通过FcγRs捕获含有免疫复合物的细胞外核酸。这些细胞随后被 激活，并从周围组织迁移到iDC经历成熟的淋巴器官。激活的DC会诱导共刺激分子(例如 CD80，CD86和PD-L1)的过量表达。此外，这些DC触发MHC II分子的重新分布和促炎细胞因子 的产生，例如相互关联的干扰素α(IFN-α)，肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素6(IL-6)。激活B 细胞和T细胞。作为调节先天性免疫应答的关键因素，IFN-1可以上调B细胞活化因子，促进B 细胞分化并抑制调节性T细胞(Treg)功能。 补体系统(Complement system)是由补体及其调节因子和相关膜蛋白组成的机体 免疫反应系统。在补体各成分中，C3的血清含量最高；在功能上，C3亦居于中心地位，它既是 几条激活途径的交汇，又是C3b依赖性阳性反馈环路的基础。经典激活途径、凝集素激活途 径及旁路激活途径三条途径可被补体激活，从而产生溶细胞、清除免疫复合物、介导炎症等 效应，同时是体内具有重要生物学作用的效应系统和效应放大系统。 狼疮患者常常补体C3、C4水平降低，C3和C4同时降低对SLE敏感度为45％，特异度 范围为88％至96％。 血清中抗双链DNA抗体的水平倾向于反映疾病的活动，但并不是在所有患者中都 如此。在既有抗双链DNA自身抗体水平升高又表现为临床病情不活动的患者中，有80％的患 者在检测到这些抗体水平升高后的5年内复发。尽管抗双链DNA抗体是狼疮中研究最广泛的 自身抗体，但其他抗体在临床表现中也起作用，特别是在自身免疫性溶血性贫血，血小板减 少症，皮肤病和新生儿狼疮中。 已证实C3的缺陷并不能够诱发狼疮，因此，C3仅有诊断价值，而缺少作为治疗靶点 的价值。 尽管“红斑狼疮”一词由19世纪的医生来描述皮肤病变，但花了将近100年的时间 才意识到这种疾病是全身性的，是由自身免疫反应异常引起的。该疾病的临床异质性迫使 3 CN 111575362 A 说 明 书 2/5 页 必须建立11条标准，而正式诊断系统性红斑狼疮(SLE)则需要满足其中4条标准。SLE的多种 临床表现给临床医生带来了挑战。 SLEDAI评分是目前最为广泛应用的评价狼疮疾病活动度的方法，但主要以临床症 状和实验室检查为评价指标，缺乏分子水平的证据。 铁死亡是一种依赖于脂质过氧化反应驱动的非凋亡性细胞死亡方式；其发生过程 需要细胞内富含可利用的铁。2012年Dixon首次发现并报道了这种新型的细胞死亡方式。铁 死亡是一种全新的细胞死亡模式，它在形态学、生物化学及遗传学方面与凋亡、焦亡、自噬 等有明显的不同。在形态学方面，发生铁死亡的细胞主要表现为线粒体体积缩小、双层膜密 度增加、线粒体脊减少或消失。生化方面，谷胱甘肽耗竭，谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性 下降，脂质氧化物不能经GPX4催化的谷胱甘肽还原反应代谢，继而二价铁离子以类似 Fenton反应的方式氧化脂质产生大量活性氧簇(ROS)，促使细胞发生铁死亡。根据已有报 道，抑制铁死亡发生的最关键分子是GPX4。对于铁死亡的发生及调控机制尚处于起始阶段， 自身免疫病领域暂时尚未有研究报道铁死亡参与自身免疫病，特别是系统性红斑狼疮的发 生。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种预测系统性红斑狼疮疾病活动度的药物。 首先，本发明提供对GPX4或其片段为反应性的抗体或者GPX4基因在制备用于预测 红斑狼疮疾病活动度的药物中的用途。 在本发明一个实施方案中，所述诊断包括：测定获自呈现红斑狼疮的患者的生物 样品中GPX4或其片段的水平，GPX4或其片段的水平与红斑狼疮疾病活动度呈负相关。 其中，GPX4或其片段的水平通过以下步骤来测量，包括： a.使来自患者的生物样品与所述抗体接触； b.在生物样品中存在的GPX4或其片段与所述抗体之间形成抗体-蛋白质复合物； c.洗涤除去任何未结合的抗体； d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体； e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体； f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。 其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有 化学发光化合物的标记物来标记。 其中，所述的对GPX4或其片段为反应性的抗体沉积或固定在固相支持物上。 其中，所述的支持物是乳胶珠子、多孔平板或膜条的形式。 在本发明另一个实施方案中，所述诊断包括：测定获自呈现自身免疫性疾病的患 者的生物样品中GPX4基因的表达水平，GPX4基因的表达水平与红斑狼疮疾病活动度呈负相 关。 其中，用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物测定GPX4基因的表达水平。 其中，所述生物样品为外周血或者外周血的中性粒细胞。 本发明还提供一种用于预测红斑狼疮疾病活动度的试剂盒，含有对GPX4或其片段 为反应性的抗体或者用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物。 4 CN 111575362 A 说 明 书 3/5 页 狼疮患者中性粒细胞的GPX4蛋白含量低于健康人，这种含量降低与疾病活动度有 关，疾病活动度越高，下降程度越严重。在有效的临床治疗后，GPX4的含量也随之上升。GPX4 中性粒细胞条件敲低的动物模型里也验证了这一点，即：中性粒细胞GPX4含量降低会诱发 小鼠出现狼疮表型。这些结果提示GPX4是一个可以预测狼疮疾病活动度的分子。 附图说明 图1所示为SLE治疗前后，中性粒细胞的GPX4蛋白含量对比，以及对应的SLEDAI评 分。 图2所示为SLE和HC的中性粒细胞的GPX4 mRNA含量对比。 图3所示为SLE和HC的中性粒细胞的GPX4蛋白含量对比，以及对应的SLEDAI评分。 图4所示为中性粒GPX4敲低小鼠的蛋白敲低效果验证。 图5所示为中性粒GPX4敲低小鼠的皮损。 图6所示为中性粒GPX4敲低小鼠的肾损伤和蛋白尿。 图7所示为中性粒GPX4敲低小鼠的血浆抗双链DNA抗体和补体C3。
本发明公开了对GPX4或其片段为反应性的抗体或者GPX4基因在制备用于预测红斑狼疮疾病活动度的药物中的用途。狼疮患者中性粒细胞的GPX4蛋白含量低于健康人，这种含量降低与疾病活动度有关，疾病活动度越高，下降程度越严重。在有效的临床治疗后，GPX4的含量也随之上升。G 全部
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)是一种严重的疾病，涉及免疫系统失调，致病性自身抗体过 量产生(及其在血清中的上调)以及多种免疫系统介导的损伤。自1982年以来，抗双链(ds) DNA抗体已成为SLE的一些经典诊断和病原学标准。抗dsDNA抗体具有不同的亚类，包括IgA， IgE，IgG和IgM。尽管如此，并非所有这些都同样对SLE的组织损伤做出了贡献。与人类疾病 活动相关的是IgG和IgA，而不是IgM。通常，核抗原，例如dsDNA，是免疫系统无法接近的，因 为它们局限于细胞核和线粒体，并被细胞质和内体中的DNase迅速降解。但是，暴露于紫外 线，感染和药物后，核材料可以从凋亡细胞中释放出来。细胞通过不同的过程经历死亡。 NETosis期间，细胞会挤出DNA和嗜中性粒细胞胞外陷阱(NETs)，其中的DNA被抗菌物质覆 盖。在细胞凋亡中，DNA裂解导致凋亡小体的形成，其中包含与DNA结合的微粒。在坏死中，细 胞裂解后释放出高分子量的DNA。释放的DNA可被抗DNA抗体识别并组成免疫复合物。未成熟 的树突状细胞(iDC)可以通过FcγRs捕获含有免疫复合物的细胞外核酸。这些细胞随后被 激活，并从周围组织迁移到iDC经历成熟的淋巴器官。激活的DC会诱导共刺激分子(例如 CD80，CD86和PD-L1)的过量表达。此外，这些DC触发MHC II分子的重新分布和促炎细胞因子 的产生，例如相互关联的干扰素α(IFN-α)，肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素6(IL-6)。激活B 细胞和T细胞。作为调节先天性免疫应答的关键因素，IFN-1可以上调B细胞活化因子，促进B 细胞分化并抑制调节性T细胞(Treg)功能。 补体系统(Complement system)是由补体及其调节因子和相关膜蛋白组成的机体 免疫反应系统。在补体各成分中，C3的血清含量最高；在功能上，C3亦居于中心地位，它既是 几条激活途径的交汇，又是C3b依赖性阳性反馈环路的基础。经典激活途径、凝集素激活途 径及旁路激活途径三条途径可被补体激活，从而产生溶细胞、清除免疫复合物、介导炎症等 效应，同时是体内具有重要生物学作用的效应系统和效应放大系统。 狼疮患者常常补体C3、C4水平降低，C3和C4同时降低对SLE敏感度为45％，特异度 范围为88％至96％。 血清中抗双链DNA抗体的水平倾向于反映疾病的活动，但并不是在所有患者中都 如此。在既有抗双链DNA自身抗体水平升高又表现为临床病情不活动的患者中，有80％的患 者在检测到这些抗体水平升高后的5年内复发。尽管抗双链DNA抗体是狼疮中研究最广泛的 自身抗体，但其他抗体在临床表现中也起作用，特别是在自身免疫性溶血性贫血，血小板减 少症，皮肤病和新生儿狼疮中。 已证实C3的缺陷并不能够诱发狼疮，因此，C3仅有诊断价值，而缺少作为治疗靶点 的价值。 尽管“红斑狼疮”一词由19世纪的医生来描述皮肤病变，但花了将近100年的时间 才意识到这种疾病是全身性的，是由自身免疫反应异常引起的。该疾病的临床异质性迫使 3 CN 111575362 A 说 明 书 2/5 页 必须建立11条标准，而正式诊断系统性红斑狼疮(SLE)则需要满足其中4条标准。SLE的多种 临床表现给临床医生带来了挑战。 SLEDAI评分是目前最为广泛应用的评价狼疮疾病活动度的方法，但主要以临床症 状和实验室检查为评价指标，缺乏分子水平的证据。 铁死亡是一种依赖于脂质过氧化反应驱动的非凋亡性细胞死亡方式；其发生过程 需要细胞内富含可利用的铁。2012年Dixon首次发现并报道了这种新型的细胞死亡方式。铁 死亡是一种全新的细胞死亡模式，它在形态学、生物化学及遗传学方面与凋亡、焦亡、自噬 等有明显的不同。在形态学方面，发生铁死亡的细胞主要表现为线粒体体积缩小、双层膜密 度增加、线粒体脊减少或消失。生化方面，谷胱甘肽耗竭，谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性 下降，脂质氧化物不能经GPX4催化的谷胱甘肽还原反应代谢，继而二价铁离子以类似 Fenton反应的方式氧化脂质产生大量活性氧簇(ROS)，促使细胞发生铁死亡。根据已有报 道，抑制铁死亡发生的最关键分子是GPX4。对于铁死亡的发生及调控机制尚处于起始阶段， 自身免疫病领域暂时尚未有研究报道铁死亡参与自身免疫病，特别是系统性红斑狼疮的发 生。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种预测系统性红斑狼疮疾病活动度的药物。 首先，本发明提供对GPX4或其片段为反应性的抗体或者GPX4基因在制备用于预测 红斑狼疮疾病活动度的药物中的用途。 在本发明一个实施方案中，所述诊断包括：测定获自呈现红斑狼疮的患者的生物 样品中GPX4或其片段的水平，GPX4或其片段的水平与红斑狼疮疾病活动度呈负相关。 其中，GPX4或其片段的水平通过以下步骤来测量，包括： a.使来自患者的生物样品与所述抗体接触； b.在生物样品中存在的GPX4或其片段与所述抗体之间形成抗体-蛋白质复合物； c.洗涤除去任何未结合的抗体； d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体； e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体； f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。 其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有 化学发光化合物的标记物来标记。 其中，所述的对GPX4或其片段为反应性的抗体沉积或固定在固相支持物上。 其中，所述的支持物是乳胶珠子、多孔平板或膜条的形式。 在本发明另一个实施方案中，所述诊断包括：测定获自呈现自身免疫性疾病的患 者的生物样品中GPX4基因的表达水平，GPX4基因的表达水平与红斑狼疮疾病活动度呈负相 关。 其中，用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物测定GPX4基因的表达水平。 其中，所述生物样品为外周血或者外周血的中性粒细胞。 本发明还提供一种用于预测红斑狼疮疾病活动度的试剂盒，含有对GPX4或其片段 为反应性的抗体或者用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物。 4 CN 111575362 A 说 明 书 3/5 页 狼疮患者中性粒细胞的GPX4蛋白含量低于健康人，这种含量降低与疾病活动度有 关，疾病活动度越高，下降程度越严重。在有效的临床治疗后，GPX4的含量也随之上升。GPX4 中性粒细胞条件敲低的动物模型里也验证了这一点，即：中性粒细胞GPX4含量降低会诱发 小鼠出现狼疮表型。这些结果提示GPX4是一个可以预测狼疮疾病活动度的分子。 附图说明 图1所示为SLE治疗前后，中性粒细胞的GPX4蛋白含量对比，以及对应的SLEDAI评 分。 图2所示为SLE和HC的中性粒细胞的GPX4 mRNA含量对比。 图3所示为SLE和HC的中性粒细胞的GPX4蛋白含量对比，以及对应的SLEDAI评分。 图4所示为中性粒GPX4敲低小鼠的蛋白敲低效果验证。 图5所示为中性粒GPX4敲低小鼠的皮损。 图6所示为中性粒GPX4敲低小鼠的肾损伤和蛋白尿。 图7所示为中性粒GPX4敲低小鼠的血浆抗双链DNA抗体和补体C3。
