技术摘要：
本发明公开了玉米ZmRLK7基因编辑靶点及其应用。本发明提供编辑玉米富亮氨酸重复的类受体激酶基因ZmRLK7的两个编辑靶点，利用两个靶点可以对ZmRLK7基因进行编辑，获得SNP、Indel、大片段删除等编辑类型，从而深入解析该基因的功能。为利用玉米ZmRLK7基因提供一种新的方  全部
背景技术：
玉米既是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，培育优良玉米品种、提高 玉米单产在国民经济的发展中占有举足轻重的地位。玉米产量取决于单株产量和种植密 度，而单株产量可以进一步剖分为穗粒数和单粒重。相对于其他复杂农艺性状，籽粒性状遗 传力高，容易度量，既是遗传研究的模式性状，也是遗传改良的重要目标性状。玉米遗传资 源丰富，然而存在于玉米中的丰富自然变异至今并未完全挖掘，控制重要农艺性状的遗传 基础也未得到深入的阐明，采用连锁分析与全基因组关联分析方法挖掘影响籽粒性状的关 键基因，并解析其功能和调控机制，构建相关的调控网络并应用于育种研究有重要的现实 和理论意义 所有生物体都通过细胞表面受体感知和传递信号。而植物中许多这种信号传导都 是通过细胞表面类受体蛋白激酶(receptor-like  protein  kinase，RLKs)介导的，其中富 含亮氨酸重复类受体蛋白激酶(Leucine-Rich  Repeats  RLKs，LRR-RLKs)是RLKs中最大的 一个家族。  LRR-RLKs是一类定位在质膜上的膜蛋白，包含感受信号的胞外域、将蛋白锚定 在膜上的跨膜域和通过自体磷酸化并通过磷酸化特定的底物将信号向下传递的胞内激酶 域(Shiu  and Bleecker,2001；Gou  et  al.,2010)。LRR-RLKs胞外域部分包括数目不同的 LRR重复，LRR重复数目的多样性赋予LRR-RLK感知不同的受体，包括小分子、肽和蛋白；激酶 域部分通常包含12个保守的亚结构域，通过折叠形成具有两个双叶结构的三维催化核心 (Hanks  et  al .,  1988；Hanks  and  Hunter ,1995)。如图3(Modified  from  Shiu  and  Bleecker,2001)所示，植物中  LRR-RLKs作为受体蛋白激酶，参与诸如植物组织和器官的生 长发育、植物激素信号响应、生物和非生物胁迫应答等信号传导过程，在植物生命活动中发 挥着重要功能。 Liu等(2015)利用已有的RNA-seq数据进行eQTL分析，鉴定了一个反式调控因子， 他们认为该基因是一个BAK1-like基因，定位在第七条染色体，我们将其命名为ZmRLK7。他 们利用一个重组自交系群体定位到一个影响粒宽和百粒重的主效QTL，分析发现ZmRLK7  与 该QTL共定位。利用三年两点的种植实验结果分析表明，在两个种植环境中ZmRLK7都与所观 测的籽粒表型如粒宽、粒厚、百粒重等呈显著的相关性。当将GWAS分析阈值提高到严谨性为 P＝1.0×10-10时，ZmRLK7可调控67个基因的表达量，因而该基因可能是一个关键的节点基 因。 尽管Liu等(2015)有些初步的预测与分析，但该基因的功能、起作用的机制和参与 的调控网络都还知之甚少，尤其是该基因在玉米或者其他作物中的遗传改良潜力也缺乏有 效的评估，这些问题值得深入研究。现代分子生物学中，利用正向或反向遗传学方法对未知 基因的功能进行鉴定是一种常用的手段，利用EMS诱变等方法获得该基因的突变体，时间 长，效率低下；目前利用基因组编辑手段对目的基因进行突变能够事半功倍，但基因编辑技 3 CN 111549037 A 说　明　书 2/4 页 术的关键一环是设计编辑靶点。
技术实现要素：
本发明克服了上述现有技术的不足，提供玉米ZmRLK7基因编辑靶点及其应用。本 发明提供编辑玉米富亮氨酸重复的类受体激酶基因ZmRLK7的两个编辑靶点，利用两个靶点 可以对ZmRLK7基因进行编辑，获得SNP、Indel、大片段删除等编辑类型，从而深入解析该基 因的功能。 本发明提供两个能有效编辑玉米ZmRLK7的基因编辑靶点，所述玉米ZmRLK7基因编 辑靶点包括Target  1和Target  2，所述Target  1定位于ZmRLK7  cDNA序列2462-2471bp位 置，其序列如SEQ  ID  NO.1所示；所述Target  2定位于ZmRLK7  cDNA序列2737-2746bp位置， 其序列如SEQ  ID  NO.2所示；上述ZmRLK7  cDNA序列如SEQ  ID  NO.7所示。 进一步的，利用上述玉米ZmRLK7基因编辑靶点对目的基因ZmRLK7进行编辑的方 法，具体包括如下步骤： (1)构建含有编辑靶点Target  1和Target  2的基因编辑载体； (2)将步骤(1)得到的基因编辑载体进行玉米遗传转化，获得转基因玉米事件； (3)取步骤(2)得到的转基因玉米事件的组织材料，提取DNA进行PCR扩增，扩增产 物测序，验证基因编辑情况。 将上述步骤(3)中的测序结果与目的基因ZmRLK7序列进行对比，若序列相同则目 的基因未被成功编辑，若测序结果显示SNP、Indel或大片段删除等，即为基因编辑成功。 进一步的，上述步骤(1)中基因编辑载体的构建的方法具体包括如下步骤： S1在基因库中调出玉米ZmR L K 7基因的序列，将序列输入网站htt p : / / crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，选择用于基因编辑的靶位点序列； S2根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列； S3以CPB-ZmUbi-hspCas9为模板，以步骤S2所述的引物序列为扩增引物，利用高保 真酶进行PCR扩增，扩增步骤S2中所述引物序列中的同源臂和靶标区，获得PCR扩增产物； S4将CPB-ZmUbi-hspCas9使用限制性内切酶切成线性，获得线性化载体； S5利用重组酶将步骤S3获得的PCR扩增产物和步骤S4中获得的线性化载体连接， 获得重组子； S6对步骤S5获得的重组子的靶点序列进行测序，测序正确的重组子即为基因编辑 载体。 进一步的，上述步骤S2中所述引物序列包括T1-F、T1-R、T2-F、T2-R； T1-F序列如SEQ  ID  NO.3所示，T1-R序列如SEQ  ID  NO.4所示，T2-F序列如SEQ  ID  NO.5 所示，T2-R序列如SEQ  ID  NO.6所示。 进一步的，上述步骤S3中所述的PCR扩增的反应体系为25μl，包括如下组分：  2× High-fidelity  Master  Mix  12.5μl，上下游引物(浓度10μM)各1μl，质粒2μl，加灭菌水8.5 μl； 所述的PCR扩增的程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s，68℃退火15s，72℃延伸 45s，循环35次；72℃过度延伸5min。 上述玉米ZmRLK7基因编辑靶点在编辑ZmRLK7基因中的应用。 4 CN 111549037 A 说　明　书 3/4 页 有益效果： (1)利用该编辑靶点可以对玉米ZmRLK7基因进行编辑，产生类型丰富的编辑类型， 如SNP、Indel、大片段删除等编辑类型。 (2)利用通过本发明中的编辑靶点所编辑的玉米ZmRLK7基因，可以获得玉米基因 编辑事件，有利于深入解析该类受体激酶基因的功能，了解其作用机制。 (3)为利用玉米ZmRLK7基因提供一种新的方式，为进一步提高玉米产量创制种质 资源。为构建玉米ZmRLK7基因内源性敲除或定点敲入外源基因提供新途径。 附图说明 图1：转基因植株的PCR检测。 图2：目的基因Target  1位点的编辑结果。 图3：目的基因Target  2位点的编辑结果。 图4：ZmRLK7基因编辑后获得的大片段删除的编辑结果。 图5：玉米遗传转化过程。