技术摘要：
本发明提供了一种分泌表达重组前动力蛋白2(PK2)的生产方法，属于生物医药技术领域。本方法通过设计筛选出合适的引物，两次扩增目的基因以获取外源基因，通过对获取的外源基因进行重建载体构建使其适于表达，并通过挑取单克隆诱导做小量表达、用保存菌种做大量表达、以  全部
背景技术：
1999年，Mollay  C等在蛙的皮肤分泌物中分离出了一种分子量约为8KD的富含半 胱氨酸残基的蛋白质，将其命名为Bv8。随后进一步的研究发现在哺乳类动物(如小鼠、大 鼠、猴子以及人类)中也有Bv8同源蛋白的存在，分别将它们命名为Prokineticin  l(PKl)和 Prokineticin  2(PK2或Bv8)。其中PK2主要与其受体PKRs相结合，促进胃肠平滑肌的收缩， 调节细胞的增殖和存活。PKRs包括Prokineticin  receptor  1(PKRl)和Prokineticin  receptor2(PKR2)，分别由位于染色体2ql4和20pl3区域上的PK0KR1和PK0KR2基因编码。 PKRl和PKR2都属于G蛋白偶联受体，两者的结构上髙度相似，差别主要是C端的序列有一定 的差异。PKRs与其配体结合后，能够通过与Gq蛋白相偶联升高细胞内钙离子浓度，影响细胞 内信号转导，参与机体多种生理过程。最初研究发现PK2可促进胃肠平滑肌的收缩，后来进 一步的研究发现PK2及PKRs在生殖系统、心血管系统以及中枢神经系统中都发挥病理生理 效应。在生殖系统中，PK2可促进睾丸血管生成，主要是通过磷酸化EKR1/2和Akt抑制血管内 皮细胞的凋亡。在心血管系统中，PK2在C57BL/6J小鼠心肌组织、H9c2细胞以及H5V细胞中都 有表达，而在终期充血性心力衰竭患者心脏中PK2的表达显著下调；进一步的研究还发现 PK2可通过PKRs激活EKR1/2和Akt信号通路促进血管生成，从而改善心脏功能和减轻心肌细 胞损伤。PKR1基因敲除小鼠的体重明显增加，出现糖尿病症状；敲除前脂肪细胞中PKR1则增 加其增殖和分化；而内皮特异性敲除PKR1的小鼠出现胰岛素抵抗，出现心脏和肾脏功能的 紊乱。PKR2转基因小鼠心功能虽然没有发生改变，但却出现心肌的异常肥大；在H5V血管内 皮细胞的研究中发现，PKR1基因下调可抑制PK2的促血管生成作用，而PKR2基因下调则对 PK2的促血管生成作用没有明显影响。在中枢神经系统中，PK2可抑制NMDA所致的皮层神经 元损伤，并可通过磷酸化EKR1/2和Akt减少低钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡。在体外脑缺血模 型中发现，PK2可减轻氧糖剥夺所致的脑片损伤，这种保护作用也与EKR1/2和Akt通路有关。 在皮层神经元中发现，PK2能够增加AMPA受体介导的电流，并且通过PKC信号通路所介导。 PK2的发现对于治疗心脑血管相关疾病具有重要的作用，但目前现有的PK2生产工艺复杂， 并且价格昂贵，因此构建一套相对简单的P2K的生产工艺，并且具有活性且价格相对低廉 PK2蛋白对其临床应用具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的技术存在的上述问题，提供一种分泌表达重组前动力 蛋白2的生产方法，本发明所要解决的技术问题是如何生产动力蛋白2。 本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种分泌表达重组前动力蛋白2的生 产方法，其特征在于，本生产方法包括如下步骤： 1.获取外源基因： 4 CN 111575276 A 说　明　书 2/7 页 1 .1第一次扩增：使用无同源臂的引物进行凝胶电泳，根据片段大小配置1％-2％ 的琼脂糖凝胶，电泳电压120V，电泳20min-30min即可，使用302nm波长的激发光激发核酸染 料，调整清晰度拍照记录并切胶回收；使用通用型胶回收试剂盒，切取DNA  marker指示的目 的条带进行胶回收，最终洗脱时加入50ul  EB溶液，无需测回收的cDNA片段浓度，直接用作 第二次扩增的模板； 1.2第二次扩增：再次PCR扩增目的基因，本次使用含同源臂的引物，具体步骤如第 一次扩增，扩增完再次胶回收。 2.重建载体构建： 2.1酶切载体：使用选定的限制性内切酶，37℃酶切3小时以上，胶回收载体； 2.2使用同源重组试剂盒进行无缝克隆； 2.3冷却连接产物的同时，将感受态细菌从-80冰箱取出，置于冰上使其融化； 2.4挑取单克隆摇菌提质粒测序； 2.5选取正确质粒转化表达菌；感受态为DE3，参数同DH5a。 3.蛋白表达纯化： 3.1挑取单克隆摇菌、保菌后诱导做小量表达 挑菌：用酒精灯灼烧冷却后的镊子夹取灭菌烘干的10ul移液器头，在平板上蘸取 单克隆菌落，将移液器头丢进15ml离心管，加入5ml  LBkana液态培养基，以火略管口和管盖， 拧紧备用； 摇菌：倾斜插入摇床，37℃，220rpm，摇菌至OD值＝0.6； 诱导：留取500ul菌液至1.5ml无菌离心管，4℃暂存，在剩余的15ml离心管中加入 4ul  2000×IPTG，继续摇菌4-6小时； 制样：转移15ml离心管至4℃离心机，水平转子，3900rpm，离心5-10min，弃干上层 培养基；用量程200ul的移液器吸取200ul  Buf .B重悬菌沉淀，转移菌液至1.5ml离心管中， 加入50ul5×Loading  Buf.，混匀；将1.5ml离心管置入沸水中，加热10-15min，后转移至-20 ℃冰箱冷却5min，取出，放入离心机，12000rpm离心5min；上样时吸取上层清液10ul，加入 1.5mm的蛋白胶，起初80V过浓缩胶，然后120V或以上继续电泳过分离胶； 转膜及染色：在300mA下转印160min，然后用丽春红染色10min，水洗： 采集：白光下观察、拍照。 3.2用保存菌种做大量表达 摇菌：将保存菌液加100ul到50ml无菌离心管中，再补充10ml-20ml  LBkana液态培 养基，过夜； 扩菌：将过夜的菌液加入1L  LBkana液态培养基中，37℃，220rpm，摇菌至OD值＝ 0.6； 诱导：加入400ul  2000×IPTG，继续摇菌4-6小时； 收菌：使用离心瓶在4℃下，以3860rpm的离心转速离心40min，收集菌液；倒掉上层 培养基，再加入5ml  Buf.A，在振荡器上重悬菌液，然后吸至高速离心管，后配平。 3.3蛋白亲和纯化 破菌：根据菌沉淀量加入Buf.B  20ml-30ml，然后加入相应体积的溶菌酶(100×) 和PMSF(100×)，先用超声探头将沉淀冲击混匀，后置入冰水中，保证冰足够；超声完将超速 5 CN 111575276 A 说　明　书 3/7 页 离心管放置于4℃冰箱，30min后取出配平；更换角转子10000rpm，4℃，离心20min；用巴氏管 吸出上清至新的50ml离心管中，置于冰上； 制柱：充分刷洗层析柱，并用ddH2O润洗一遍，塞入塑料垫，固定于铁架台，加入1ml  Ni-NTA  beads，用10倍体积的Buf.B去平衡该柱子； 加样：用吸管缓慢加入上清，避免飞溅，保证流速1.5s-1滴，直至全部流穿，用50ml 离心管接取流穿液； 洗杂：更换50ml离心管，缓慢加入Buf.C，保证流速，流穿3个柱子体积的Buf.C后， 用“Modified  Bradford  reagent”检测残留蛋白含量，若洗杂不充分继续流穿Buf.C，直至 变色不明显为止； 超滤：更换水平转子，在4℃下，以3860rpm超滤至残留200ul，后加入2ml灭菌0.9％ NaCl重悬，后继续离心至200ul，再加入2ml灭菌0.9％NaCl重悬，继续离心至200ul，取出，加 入1ml灭菌0.9％NaCl重悬，用200ul移液器吸至离心管中即得目标蛋白； 检测浓度：使用BCA试剂盒检测纯化的蛋白浓度。 需要说明的是：本方法采用的外源引物的详情以核苷酸序列表的形式表述和公 开。 附图说明 图1是第二次PCR扩增目的基因回收的拍照图。 图2是白光下观察蛋白表达纯化的拍照图。