技术摘要：
本发明公开了一种脂肪组织细胞外基质的制备方法，属于组织工程与再生医学、临床医学技术领域。其包括如下步骤：取新鲜脂肪组织，进行预处理，再进行冻融处理；将冻融处理后的脂肪组织进行破碎，得到破碎后的脂肪组织；再依次经过高渗氯化钠溶液清洗、第一次无菌去离子  全部
背景技术：
外伤、肿瘤、先天畸形以及衰老等造成的组织缺损是整形外科工作的重点,自体组 织移植和组织工程材料移植是修复组织缺损的两种主要策略。虽然自体组织移植能获得理 想的治疗效果，但付出的代价却是大面积手术创伤和供区遗留瘢痕，甚至可能发生较为严 重的并发症。而组织工程材料移植具有手术操作简单、创伤小等特点，在组织移植中具有独 特的优势。组织工程的三要素分别是组织工程材料、种子细胞和生长因子。其中，支架材料 是组织工程领域的核心课题之一，能够为种子细胞提供结构支持和生物力学支撑，与信号 分子共同调节细胞的粘附、迁移、增殖、分化等生物学行为，成为种子细胞和生长因子之间 的重要桥梁。天然支架材料具有良好的生物相容性，可以通过分泌或募集生长因子与种子 细胞及其周围微环境产生动态的相互作用，从而促进细胞的粘附和增殖能力，甚至诱导种 子细胞向特定细胞类型进行分化。 脂肪组织细胞外基质作为人体组织中的重要组成部分，成为学者们关注的重点。 脂肪组织来源广泛、获取容易，为制备细胞外基质提供了丰富的原材料。脂肪组织细胞外基 质由胶原纤维、弹性纤维等纤维成分以及糖胺聚糖、可溶性生长因子等构成，可以为细胞提 供结构支撑和信号传递。有研究表明，特定组织来源的细胞外基质更适合于其自身来源的 细胞生长。而脂肪组织细胞外基质可能会诱导脂肪干细胞成脂分化形成脂肪细胞，从而可 以更有效的维持组织容量，有望将组织工程材料转化为自身组织的一部分。因此，在以组织 容量填充为应用目标的前提下，脂肪组织成为制备细胞外基质的首要选择。 脱细胞技术是制备细胞外基质的关键，其核心是通过物理、化学或生物酶等方法 去除天然组织内的固有细胞和遗传物质并降低或去除材料的免疫原性。目前，已经成功利 用脱细胞技术制备出人工真皮、气管、神经、小肠黏膜、韧带、肺、肾、心脏包膜、脂肪组织等 多种组织和器官的脱细胞支架材料。但脱细胞技术在去除细胞成分和遗传物质的同时，也 不可避免会对细胞外基质造成损伤。如何才能在有效脱细胞的同时保留细胞外基质上的活 性成分和生长因子，成为组织工程学的研究热点。目前脱细胞的方法主要有物理法、化学 法、生物酶法和联合法。物理法主要包括冻融法、高水压法和超临界二氧化碳法。虽然物理 法相对温和，能够保留细胞外基质的有效成分，对物理结构损伤较小，但单独使用不能完全 去除细胞成分和遗传物质，需要与其他方法合用。化学法是通过溶解细胞膜的磷脂成分而 达到脱细胞效果，常用的化学试剂包括十二烷基硫酸钠(Sodium  dodecyl  sulfate，SDS)、 脱氧胆酸钠(Sodium  deoxycholate，SD)和Triton  X-100等。化学试剂可以实现较强的脱细 胞作用，但容易残留或凝集在细胞外基质材料上，为了减少残留物的影响，需要额外增加洗 涤时间，不仅会降低脱细胞效率，而且在反复洗涤过程中糖胺聚糖(Glycosaminoglycans， GAG)和生长因子的含量也会随之减少，从而影响细胞的粘附和生长能力。生物酶法是利用 4 CN 111603610 A 说　明　书 2/13 页 酶的水解作用去除细胞成分或切断细胞与细胞外基质之间连接的肽键。常用的生物酶主要 有胰蛋白酶、核酸酶和脂肪酶。胰蛋白酶可以直接用于去除细胞外基质上的细胞成分，并且 作用效果会随作用时间而增加，但长时间处于胰蛋白酶的环境下会降低细胞外基质中弹性 蛋白和GAG含量。核酸酶常与化学试剂SDS或SD联合使用，有助于在化学试剂破坏细胞膜释 放出遗传物质后，进一步水解细胞核物质,但核酸酶会对细胞外基质的表面结构造成损伤， 影响细胞的粘附和增殖。 鉴于每种脱细胞方法各有其优势和劣势，大多数学者选择将物理、化学或生物酶 法进行综合，根据预期使用目标选择合适的方法和作用时间，以利于保留更多天然成分。通 常首先使用物理法(如冻融等)有利于保持细胞外基质的微观结构，然后再使用一定浓度的 化学试剂和/或生物酶，这样的脱细胞顺序有利于保留细胞外基质与不同生物活性分子和 信号位点相结合的能力。加拿大学者Flynn于2009年提出脂肪组织细胞外基质的制备方法， 这种方法需要使用多种生物酶，如胰蛋白酶、核酸酶和脂肪酶，生物酶的使用增加了该方法 的局限性。一方面，生物酶价格昂贵，极大的提高了制备成本；另一方面，由于以上酶类均为 牛或猪等异种属来源，这在制备人脂肪组织细胞外基质的过程中，提高了引入异种抗原的 风险。 鉴于此，有必要提供一种新的脂肪组织细胞外基质制备方法，以解决现有技术的 不足。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种脂肪组织细胞外基质的制备方 法。本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法，在脱细胞过程中不需酶的参与，一是极大的 降低制备成本，二是减少异种属抗原成分导致排斥反应的风险，三是能够保留细胞外基质 的天然结构和活性因子，四是可以实现更有效的脱细胞结果，五是体内成脂能力更强。 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种脂肪组织细胞外基质的制备方 法，包括如下步骤： 取新鲜脂肪组织，进行预处理，再进行冻融处理； 将上述冻融处理后的脂肪组织进行破碎，得到破碎后的脂肪组织； 将上述破碎后的脂肪组织，依次经过高渗氯化钠溶液清洗、第一次无菌去离子水 洗涤、Triton  X-100溶液清洗、第二次无菌去离子水洗涤、异丙醇析出油脂、第三次无菌去 离子水洗涤和酒精洗脱RNA，即得到脂肪组织细胞外基质。 本发明的原理是： 针对现有技术的Flynn法制备脂肪组织细胞外基质存在的各种问题，本申请提出 一种以物理方法为主，不需使用生物酶的制备方法。具体是： 本发明中，新鲜的脂肪组织来源于中国医学科学院北京协和医学院整形外科医 院，乳房整形与美容中心进行脂肪抽吸术的健康成年女性，经患者知情同意后使用，并经过 医院伦理委员会批准。获取的新鲜脂肪组织于无菌条件下保存，置于4℃恒温保存箱内，2小 时内送到实验室进行后续的预处理。 采用人的脂肪组织制备细胞外基质，一是产物表面不存在异种属抗原，有利于减 少免疫排斥反应，也有助于避免种属间病毒的传播。二是脂肪抽吸术后会产生大量脂肪组 5 CN 111603610 A 说　明　书 3/13 页 织，中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院每年有超过2000例脂肪吸脂手术，每台 手术会产生50ml-4000ml脂肪组织与肿胀液的混合物，预处理后会获得至少20ml-2000ml的 脂肪组织。通常吸脂术后的脂肪组织会被当作医疗垃圾处理掉，处理这些脂肪组织会消耗 大量的人力、物力和财力。而本发明采用废弃的脂肪组织作为原材料，对医疗垃圾进行再利 用，有利于节约成本和环境保护。 本发明还与Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质进行对比，分别从脱细胞效力、吸 水率、60μm-200μm直径孔隙占比、DNA残留量方面对比，以及体内移植后成脂能力方面进行 考察，得到的结论如下： 1、本发明的制备方法，可以实现有效的脱细胞，同时保留胶原成分。 2、吸水率方面，本发明制备的脂肪组织细胞外基质吸水率与Flynn法制备的脂肪 组织细胞外基质没有差异；60μm-200μm直径孔隙占比方面，本发明制备的脂肪组织细胞外 基质较Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质，有明显提高；DNA残留量方面，本发明制备的脂 肪组织细胞外基质较Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质，有明显降低；体内移植后成脂能 力方面，本发明制备的脂肪组织细胞外基质较Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质，有明显 提高。 本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法的有益效果是： 1、本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法，在脱细胞过程中不需生物酶的参 与，一是极大的降低制备成本，二是减少异种属抗原成分导致排斥反应的风险，三是能够保 留细胞外基质的天然结构和活性因子，四是可以实现更有效的脱细胞结果，五是体内成脂 能力更强。 2、本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法，通过物理方法对脂肪组织进行破 碎，就可以达到分离细胞和细胞外基质和破坏脂肪细胞的效果，操作更加方便快捷，成本更 加低廉，具有广阔的应用前景。 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。 进一步，所述预处理的方法是：取新鲜的脂肪组织，静置10min-15min，弃去油滴、 血液，加入PBS缓冲液清洗3次，即得到预处理后的脂肪组织。 采用上述进一步的有益效果是：经过预处理，可以去除残存的油滴、血液和肿胀 液。一般而言，PBS缓冲液的加入体积，与弃去油滴、血液和肿胀液后的脂肪组织的体积相 同。 进一步，所述冻融处理的方法是：将预处理后的脂肪组织于-80℃冷冻2h后，于37 ℃融化；共进行上述冻融过程3次，即得到冻融处理后的脂肪组织。 采用上述进一步的有益效果是：对预处理后的脂肪组织进行冻融循环,可以在细 胞内形成冰晶并快速融化，利用细胞内的冰晶破碎脂肪细胞。采用冻融循环对细胞外基质 的微观结构、机械强度、GAG含量和胶原蛋白含量等损伤较小。 进一步，所述破碎后的脂肪组织呈乳糜状，所述破碎的方法为研钵法、捣碎法、振 荡法、搅拌法、匀浆法、温差法、压差法、超声法和注射器法中的任意一种或两种以上的组 合。 采用上述进一步的有益效果是：脂肪组织呈乳糜状，更有利于后续的处理。破碎可 以采用多种方式，只要能达到本发明所需要的组织形态，均能达到同样的技术效果。其中， 6 CN 111603610 A 说　明　书 4/13 页 研钵法，是采用研钵进行研磨，来破碎脂肪组织。捣碎法，一般是指使用捣碎机，来破碎脂肪 组织。振荡法和搅拌法是借助振荡器或者搅拌器，来破碎脂肪组织。匀浆法，是指利用高压 来破碎脂肪组织。温差法，是指通过反复冻融或急热骤冷等温度变化来达到破碎脂肪组织 的目的。压差法，是指使用加压的方法，来破碎脂肪组织。超声法，一般是采用功率为15KHz- 20KHz的超声波，使脂肪组织在高强度急剧振动下破碎。注射器法，是指采用注射器，来破碎 脂肪组织，包括连通管法、空气法和针头法。 进一步，所述高渗氯化钠溶液清洗的具体方法是：在破碎后的脂肪组织中，加入至 少一倍体积于上述破碎后的脂肪组织的无菌0 .5M氯化钠溶液，37℃恒温摇床，转速为 100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min，去除溶液；然后加入至少一倍体积于上述破碎后的脂 肪组织的无菌1M氯化钠溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min， 去除溶液，得到高渗氯化钠清洗后的脂肪组织。 采用上述进一步的有益效果是：冻融处理后的脂肪组织经过破碎后，释放出大量 脂滴，且破碎后的脂肪组织经过高渗氯化钠溶液清洗后，借助渗透压差破坏细胞膜并促进 细胞裂解和DNA与蛋白质解离。 进一步，所述第一次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在高渗氯化钠溶液清洗后 的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述高渗氯化钠溶液清洗后的脂肪组织的无菌去离子 水，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min，去除溶液，得到第一次无菌 去离子水洗涤后的脂肪组织。 采用上述进一步的有益效果是：经过第一次无菌去离子水清洗，可以去除脂肪组 织内残留的高渗氯化钠溶液。 进一步，所述Triton  X-100溶液清洗的具体方法是：在第一次无菌去离子水清洗 后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述去离子水清洗后的脂肪组织的体积百分浓度为 1％的Triton  X-100溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡48h，且每24h更换新的质量百 分数为1％的Triton  X-100溶液3次，再1000rpm离心5min，去除溶液，得到Triton  X-100溶 液清洗后的脂肪组织。 采用上述进一步的有益效果是：使用体积百分浓度为1％的Triton  X-100溶液，溶 解细胞膜的磷脂成分从而去除细胞成分及遗传物质。 进一步，所述第二次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在Triton  X-100溶液清洗 后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述Triton  X-100溶液清洗后的脂肪组织的无菌去 离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行 上述第二次无菌去离子水洗涤过程3次，得到第二次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。 采用上述进一步的有益效果是：通过第二次无菌去离子水洗涤，可以去除脂肪组 织内残留的Triton  X-100溶液。 进一步，所述异丙醇析出油脂的具体方法是：在第二次无菌去离子水洗涤后的脂 肪组织中，加入至少一倍体积于上述无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的异丙醇，37℃恒温 摇床，转速为100rpm，震荡8h；再1000rpm离心5min，去除溶液，得到析出油脂后的脂肪组织。 采用上述进一步的有益效果是：通过异丙醇析出油脂，可以获得不含油脂和细胞 成分的脂肪组织细胞外基质。 进一步，所述第三次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在析出油脂后的脂肪组织 7 CN 111603610 A 说　明　书 5/13 页 中，加入至少一倍体积于上述析出油脂后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速 为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行上述第三次无菌去离子水洗 涤过程3次，得到第三次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。 采用上述进一步的有益效果是：通过无菌去离子水洗涤，可以去除脂肪组织内残 留的异丙醇溶液。 进一步，所述酒精洗脱RNA的具体方法是：在第三次无菌去离子水洗涤后的脂肪组 织中，加入至少一倍体积于上述无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的75％体积的酒精，37℃ 恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行上述酒精洗脱 RNA过程3次，即得到脂肪组织细胞外基质。 采用上述进一步的有益效果是：通过酒精洗脱，可以消除RNA水化层，使RNA发生沉 淀并去除。 进一步，所述脂肪组织细胞外基质储存于含体积百分数为1％的双抗的无菌去离 子水内，真空冷冻干燥，即得到块状的脂肪组织细胞外基质。 采用上述进一步的有益效果是：经过冷冻干燥后，得到的块状的脂肪组织细胞外 基质，为疏松多孔状。后续可以研磨成粉末，适合各种应用场景，比如后续的皮下注射，非常 方便保存和使用。 更进一步，所述真空冷冻干燥的具体参数为：先抽真空到7.98Pa，保持在-30℃，干 燥16h；再保持在-20℃，干燥16h；然后保持在20℃，干燥9h。 采用上述更进一步的有益效果是：采用上述参数，真空冷冻干燥的效果最佳。 附图说明 图1为本发明的实施例步骤1得到的预处理后的脂肪组织的外观图。 图2为本发明的实施例步骤3得到的破碎后的乳糜状脂肪组织的外观图。 图3为本发明的实施例步骤4得到的0.5M氯化钠清洗后的脂肪组织的外观图。 图4为本发明的实施例步骤4得到的1M氯化钠清洗后的脂肪组织的外观图。 图5为本发明的实施例步骤5得到的无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的外观图。 图6为本发明的实施例步骤6得到的体积百分浓度为1％Triton  X-100溶液清洗后 的脂肪组织的外观图。 图7为本发明的实施例步骤8得到的析出油脂后的脂肪组织的外观图。 图8为本发明的实施例制备得到的脂肪组织细胞外基质的外观图。 图9为本发明的实施例制备得到的脂肪组织细胞外基质经冻干后的外观图。 图10为新鲜的脂肪组织的油红O染色图。比例尺为200μm。 图11为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质的油红O染色图。比例尺为200μ m。 图12为新鲜的脂肪组织的DAPI染色图。比例尺为200μm。 图13为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质的DAPI染色图。比例尺为200μm。 图14为新鲜的脂肪组织的Masson染色图。比例尺为200μm。 图15为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质的Masson染色图。比例尺为200μ m。 8 CN 111603610 A 说　明　书 6/13 页 图16为新鲜的脂肪组织的天狼猩红染色图。比例尺为200μm。 图17为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质的天狼猩红染色图。比例尺为 200μm。 图18为新鲜的脂肪组织的扫描电镜图。比例尺为100μm。 图19为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质在未冻干时的扫描电镜图。比例 尺为100μm。 图20为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质在冻干后的扫描电镜图。比例尺 为500μm。 图21为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质在冻干后的扫描电镜图。比例尺 为100μm。 图22为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质在冻干后的扫描电镜图。比例尺为500 μm。 图23为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质在冻干后的扫描电镜图。比例尺为100 μm。 图24为本发明实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质的吸水率对比图。 图25为本发明实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质的孔隙直径在60-200 μm占比百分比的对比图。 图26为本发明的实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质的DNA残留量对比 图。 图27为本发明实施例和Flynn法制备的细胞外基质冻干后，研磨成粉末状，取5mg 与生理盐水混合，注射到裸鼠皮下(n＝5)，并于第1周、第2周和第4周取材，样本重量的对比 图。 图28为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植1周后的Perilinpin染 色图。比例尺为100μm。 图29为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植1周后的Perilinpin染色图。 比例尺为100μm。 图30为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植2周后的Perilinpin染 色图。比例尺为100μm。 图31为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植2周后的Perilinpin染色图。 比例尺为100μm。 图32为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植4周后的Perilinpin染 色图。比例尺为100μm。 图33为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植4周后的Perilinpin染色图。 比例尺为100μm。 图34为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植1周、2周和4周后的 Perilinpin染色呈阳性的脂肪细胞个数图。