技术摘要：
本发明公开了一种具有还原敏感性、抗肿瘤作用的两亲性透明质酸‑胱胺‑油酸聚合物和该载体的制备，及其作为药物载体在药物传递中的应用，属于药物制剂新辅料和新剂型领域。本发明的透明质酸‑胱胺‑油酸聚合物以透明质酸作为亲水端，以二硫键为桥连，链接疏水性的油酸 全部
背景技术：
纳米载体能够增加药物的稳定性，提高生物利用度，改变药物的体内过程，减少药 物副作用，提高药物作用的靶向性等，因而被广泛用于靶向药物传递系统。 透明质酸(HA)是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的基本双糖单元重复连 接构成的天然线性黏多糖。透明质酸和蛋白质、核酸一样，是构成细胞基质和细胞间质的主 要成分，在维持细胞基质结构及调节细胞内活动等方面都起着重要的作用，能通过引发受 体介导的细胞内信号传递参与调解细胞内活动，发挥着影响细胞移动、增殖和分化等多种 生物学功能。此外其结构中有羧基，羟基和酰胺基有利于载体材料的修饰，因此在药物递送 系统中应用广泛。HA作为肿瘤靶向的载体，主要通过受体介导作用增加病灶区药物的浓度， 从而达到靶向治疗的目的。CD44受体是肿瘤细胞表面最重要的HA受体，是与HA结合的主要 部位。它可增强HA与肿瘤细胞结合和内化的能力，对肿瘤血管的生成、肿瘤转移性及侵袭性 等具有重要的调节作用。因此，HA既作为肿瘤主动靶向配体又作为纳米载体而构建纳米药 物传递系统已经成为抗肿瘤靶向纳米药物传递系统研究热点之一。 近年来，越来越多的肿瘤微环境响应纳米制剂被研发，它们在特殊因素(pH，还原 剂，酶，离子强度等)的影响下载体胶束会被破坏，从而实现药物的快速释放。其中还原响应 纳米粒被广泛研究，因为肿瘤细胞内外还原剂的浓度具有明显的差异。谷胱甘肽(GSH)是一 种内源性的还原剂，GSH在肿瘤细胞外，浓度很低，大约1-10uM，而肿瘤细胞内GSH浓度高达 1-10mM，这种明显的浓度差可引发还原敏感制剂在肿瘤细胞内快速释放药物。到目前为止， 许多报到已经证实还原敏感制剂与非还原敏感制剂相比，具有更好的药效。 针对肿瘤细胞表面有过表达的HA特异性受体，以及肿瘤微环境具有较高的谷胱甘 肽浓度，本发明将两者特点结合起来共同实现将药物准确送至肿瘤组织处，通过将亲水物 质HA与疏水物质油酸(OA)用二硫键连接起来，形成两亲性物质，从而实现在水中可以自组 装成胶束溶液将疏水性多西他赛(DTX)包载进去并靶向递送至肿瘤部位，在高浓度的谷胱 甘肽作用下二硫键断裂使药物释放出来，从而克服了药物分子进入血液循环后难以实现体 内的有效分布或被快速消除所带来的毒副作用。 二硫键是一种还原敏感键，在非还原条件下可稳定的存在，而在还原条件下可发 生断裂反应。OA是一种疏水性较强的化合物，且对正常细胞没有毒性，可以将其作为聚合物 纳米粒的疏水段。HA作为亲水基，能形成空间立体屏障，可以通过肿瘤细胞表面过表达的透 明质酸特异性受体使更多纳米粒聚集在肿瘤部位。通过将亲水物质HA与疏水物质OA用二硫 键连接起来，形成两亲性还原敏感性的功能性嵌段共聚物，从而实现在水中可以自组装成 纳米粒子溶液将疏水性紫衫烷类药物(如DTX)包载进去并靶向递送至肿瘤部位，在高浓度 4 CN 111592605 A 说 明 书 2/9 页 的谷胱甘肽作用下二硫键断裂使药物释放出来，从而克服了药物分子进入血液循环后难以 实现体内的有效分布或被快速消除所带来的毒副作用。将此种嵌段共聚物作为载体应用于 药物传递系统，将具有很大的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有还原敏感性和对肿瘤细胞具有靶向性的多功能 的两亲性透明质酸-胱胺-油酸(HA-Cy-OA)聚合物。 本发明第二个目的在于提供上述多功能的两亲性透明质酸-胱胺-油酸共聚物的 制备方法。 本发明的第三个目的是多功能两亲性透明质酸-胱胺-油酸共聚物在包载抗肿瘤 药物中的应用，不仅能减少抗肿瘤药物副作用，还能增加其靶向性，提高抗肿瘤药物的生物 利用度。 本发明通过以下技术方案实现上述目的： 一种由二硫键桥连的HA、OA组成的两亲性共聚物是一种稳定性好、功能性强、包封 率高的药物增溶载体。 该两亲性共聚物载体由透明质酸为亲水端，以二硫键为桥连，链接疏水性的油酸。 所述的两亲性透明质酸-胱胺-油酸共聚物(Ⅰ)的结构通式如下： n为42到250个透明质酸单元； 所用的透明质酸的分子量为16000～100000道尔顿。 所述的透明质酸-胱胺-油酸聚合物中，油酸胱胺的取代度范围为10％～50％。 本发明还提供了上述透明质酸-胱胺-油酸(HA-Cy-OA)共聚物的制备方法，包括如 下步骤： (a)将油酸和1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于N,N-二甲基乙 基胺(DMF)中，随后加入1-羟基苯并三唑(HOBT)、胱胺(Cy-OA)和N ,N-二异丙基乙胺 (DIPEA) ,室温搅拌48-72h，得式(Ⅱ)化合物，即油酸胱胺。反应式如下： 5 CN 111592605 A 说 明 书 3/9 页 (b)式(Ⅱ)化合物在EDC，DIPEA和HOBT催化作用下，与HA于40-50℃条件下反应，得 到(Ⅲ)，反应式如下： 其中，n为42到250个透明质酸单体，OA为油酸，Cy为胱胺二盐酸盐，HA为透明质酸。 所述的透明质酸-胱胺-油酸(HA-Cy-OA)具有还原敏感性和特异性靶向高表达 CD44受体的肿瘤细胞的特征。 所述的两亲性的HA-Cy-OA，可作为难溶性药物增溶载体，其中难溶性药物可为紫 6 CN 111592605 A 说 明 书 4/9 页 衫烷类、喜树碱类、蒽醌类抗肿瘤药或二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生 物。 在本发明的较佳实施例中，所述的难溶性药物选自紫杉烷和喜树碱中的一种。 在本发明的较佳实施例中，所述的难溶性药物为多西他赛。 本发明还提供了一种透明质酸-胱胺-油酸聚合物载药纳米粒，所述的载药纳米粒 由透明质酸-胱胺-油酸聚合物和疏水性药物组成，其重量组成比为：40：1～10:1。 所制备的纳米粒子的粒径为320-370nm。 所述的聚合物纳米粒子可采用薄膜分散法制备，采用下述步骤： 薄膜分散法是将上述的聚合物和药物同时溶解于有机溶剂(如甲醇、二氯甲烷 等)，旋转蒸发除有机溶剂，得到药物和载体的薄膜，加入水搅拌2-5h，离心，过滤除去不溶 物，得到载药纳米粒子。 本发明具有以下有益效果：本发明制备了一种新型的多功能的两亲性嵌段共聚物 HA-Cy-OA，载体制备过程所涉及的方法仪器设备要求简单、制备过程简单可控、易规模化； 所制备的载药聚合物纳米粒子，制备简便，粒径较小且均一，包封率高，稳定性好；可作为难 溶性药物、蛋白质或基因药物的储库；被动靶向和主动靶向结合而实现对肿瘤细胞的高度 靶向性能，提高靶向效率，实现肿瘤的高效低毒治疗；亲水高分子表面性能实现纳米复合物 的血液长效循环，增强药物的水溶性进而增强其在血液中的稳定性；药物载体材料均为可 降解生物材料，具有高的生物相容性，低的免疫原性和细胞毒性；因此适于制备紫杉醇、多 西紫杉醇、喜树等价格昂贵且水溶性差、生物利用度差的抗肿瘤药物递送系统，作为抗肿瘤 药物新剂型有着广阔的市场前景和潜在的肿瘤临床治疗价值。 附图说明 图1为本发明实施例1的Cy-OA结构的1HNMR谱图和质谱图。 图2为本发明实施例2的HA-Cy-OA结构的1HNMR谱图。 图3为本发明实施例3的DTX/HA-Cy-OA NPs的透视电镜图。 图4为本发明实施例4的DTX/HA-Cy-OA NPs在还原条件下和生理条件下的粒径和 PDI变化图。 图5为本发明实施例5的DTX/HA-Cy-OA NPs的体外释放曲线。 图6为本发明实施例6的MTT法测定DTX/HA-Cy-OA NPs对于MCF-7，MDA-MB-231和 A549细胞的细胞存活率曲线图。 图7为本发明实施例7的DTX/HA-Cy-OA NPs体内药效实验中肿瘤体积生长曲线(V- t)图。 图8为本发明实施例7的DTX/HA-Cy-OA NPs体内药效试验中肿瘤图。 图9为本发明实施例7的DTX/HA-Cy-OA NPs体内药效实验中小鼠体重变化折线(V- t)图。 图10为本发明实施例7的DTX/HA-Cy-OA NPs体内药效实验中小鼠荷瘤率图。
本发明公开了一种具有还原敏感性、抗肿瘤作用的两亲性透明质酸‑胱胺‑油酸聚合物和该载体的制备，及其作为药物载体在药物传递中的应用，属于药物制剂新辅料和新剂型领域。本发明的透明质酸‑胱胺‑油酸聚合物以透明质酸作为亲水端，以二硫键为桥连，链接疏水性的油酸 全部
背景技术：
纳米载体能够增加药物的稳定性，提高生物利用度，改变药物的体内过程，减少药 物副作用，提高药物作用的靶向性等，因而被广泛用于靶向药物传递系统。 透明质酸(HA)是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的基本双糖单元重复连 接构成的天然线性黏多糖。透明质酸和蛋白质、核酸一样，是构成细胞基质和细胞间质的主 要成分，在维持细胞基质结构及调节细胞内活动等方面都起着重要的作用，能通过引发受 体介导的细胞内信号传递参与调解细胞内活动，发挥着影响细胞移动、增殖和分化等多种 生物学功能。此外其结构中有羧基，羟基和酰胺基有利于载体材料的修饰，因此在药物递送 系统中应用广泛。HA作为肿瘤靶向的载体，主要通过受体介导作用增加病灶区药物的浓度， 从而达到靶向治疗的目的。CD44受体是肿瘤细胞表面最重要的HA受体，是与HA结合的主要 部位。它可增强HA与肿瘤细胞结合和内化的能力，对肿瘤血管的生成、肿瘤转移性及侵袭性 等具有重要的调节作用。因此，HA既作为肿瘤主动靶向配体又作为纳米载体而构建纳米药 物传递系统已经成为抗肿瘤靶向纳米药物传递系统研究热点之一。 近年来，越来越多的肿瘤微环境响应纳米制剂被研发，它们在特殊因素(pH，还原 剂，酶，离子强度等)的影响下载体胶束会被破坏，从而实现药物的快速释放。其中还原响应 纳米粒被广泛研究，因为肿瘤细胞内外还原剂的浓度具有明显的差异。谷胱甘肽(GSH)是一 种内源性的还原剂，GSH在肿瘤细胞外，浓度很低，大约1-10uM，而肿瘤细胞内GSH浓度高达 1-10mM，这种明显的浓度差可引发还原敏感制剂在肿瘤细胞内快速释放药物。到目前为止， 许多报到已经证实还原敏感制剂与非还原敏感制剂相比，具有更好的药效。 针对肿瘤细胞表面有过表达的HA特异性受体，以及肿瘤微环境具有较高的谷胱甘 肽浓度，本发明将两者特点结合起来共同实现将药物准确送至肿瘤组织处，通过将亲水物 质HA与疏水物质油酸(OA)用二硫键连接起来，形成两亲性物质，从而实现在水中可以自组 装成胶束溶液将疏水性多西他赛(DTX)包载进去并靶向递送至肿瘤部位，在高浓度的谷胱 甘肽作用下二硫键断裂使药物释放出来，从而克服了药物分子进入血液循环后难以实现体 内的有效分布或被快速消除所带来的毒副作用。 二硫键是一种还原敏感键，在非还原条件下可稳定的存在，而在还原条件下可发 生断裂反应。OA是一种疏水性较强的化合物，且对正常细胞没有毒性，可以将其作为聚合物 纳米粒的疏水段。HA作为亲水基，能形成空间立体屏障，可以通过肿瘤细胞表面过表达的透 明质酸特异性受体使更多纳米粒聚集在肿瘤部位。通过将亲水物质HA与疏水物质OA用二硫 键连接起来，形成两亲性还原敏感性的功能性嵌段共聚物，从而实现在水中可以自组装成 纳米粒子溶液将疏水性紫衫烷类药物(如DTX)包载进去并靶向递送至肿瘤部位，在高浓度 4 CN 111592605 A 说 明 书 2/9 页 的谷胱甘肽作用下二硫键断裂使药物释放出来，从而克服了药物分子进入血液循环后难以 实现体内的有效分布或被快速消除所带来的毒副作用。将此种嵌段共聚物作为载体应用于 药物传递系统，将具有很大的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有还原敏感性和对肿瘤细胞具有靶向性的多功能 的两亲性透明质酸-胱胺-油酸(HA-Cy-OA)聚合物。 本发明第二个目的在于提供上述多功能的两亲性透明质酸-胱胺-油酸共聚物的 制备方法。 本发明的第三个目的是多功能两亲性透明质酸-胱胺-油酸共聚物在包载抗肿瘤 药物中的应用，不仅能减少抗肿瘤药物副作用，还能增加其靶向性，提高抗肿瘤药物的生物 利用度。 本发明通过以下技术方案实现上述目的： 一种由二硫键桥连的HA、OA组成的两亲性共聚物是一种稳定性好、功能性强、包封 率高的药物增溶载体。 该两亲性共聚物载体由透明质酸为亲水端，以二硫键为桥连，链接疏水性的油酸。 所述的两亲性透明质酸-胱胺-油酸共聚物(Ⅰ)的结构通式如下： n为42到250个透明质酸单元； 所用的透明质酸的分子量为16000～100000道尔顿。 所述的透明质酸-胱胺-油酸聚合物中，油酸胱胺的取代度范围为10％～50％。 本发明还提供了上述透明质酸-胱胺-油酸(HA-Cy-OA)共聚物的制备方法，包括如 下步骤： (a)将油酸和1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于N,N-二甲基乙 基胺(DMF)中，随后加入1-羟基苯并三唑(HOBT)、胱胺(Cy-OA)和N ,N-二异丙基乙胺 (DIPEA) ,室温搅拌48-72h，得式(Ⅱ)化合物，即油酸胱胺。反应式如下： 5 CN 111592605 A 说 明 书 3/9 页 (b)式(Ⅱ)化合物在EDC，DIPEA和HOBT催化作用下，与HA于40-50℃条件下反应，得 到(Ⅲ)，反应式如下： 其中，n为42到250个透明质酸单体，OA为油酸，Cy为胱胺二盐酸盐，HA为透明质酸。 所述的透明质酸-胱胺-油酸(HA-Cy-OA)具有还原敏感性和特异性靶向高表达 CD44受体的肿瘤细胞的特征。 所述的两亲性的HA-Cy-OA，可作为难溶性药物增溶载体，其中难溶性药物可为紫 6 CN 111592605 A 说 明 书 4/9 页 衫烷类、喜树碱类、蒽醌类抗肿瘤药或二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生 物。 在本发明的较佳实施例中，所述的难溶性药物选自紫杉烷和喜树碱中的一种。 在本发明的较佳实施例中，所述的难溶性药物为多西他赛。 本发明还提供了一种透明质酸-胱胺-油酸聚合物载药纳米粒，所述的载药纳米粒 由透明质酸-胱胺-油酸聚合物和疏水性药物组成，其重量组成比为：40：1～10:1。 所制备的纳米粒子的粒径为320-370nm。 所述的聚合物纳米粒子可采用薄膜分散法制备，采用下述步骤： 薄膜分散法是将上述的聚合物和药物同时溶解于有机溶剂(如甲醇、二氯甲烷 等)，旋转蒸发除有机溶剂，得到药物和载体的薄膜，加入水搅拌2-5h，离心，过滤除去不溶 物，得到载药纳米粒子。 本发明具有以下有益效果：本发明制备了一种新型的多功能的两亲性嵌段共聚物 HA-Cy-OA，载体制备过程所涉及的方法仪器设备要求简单、制备过程简单可控、易规模化； 所制备的载药聚合物纳米粒子，制备简便，粒径较小且均一，包封率高，稳定性好；可作为难 溶性药物、蛋白质或基因药物的储库；被动靶向和主动靶向结合而实现对肿瘤细胞的高度 靶向性能，提高靶向效率，实现肿瘤的高效低毒治疗；亲水高分子表面性能实现纳米复合物 的血液长效循环，增强药物的水溶性进而增强其在血液中的稳定性；药物载体材料均为可 降解生物材料，具有高的生物相容性，低的免疫原性和细胞毒性；因此适于制备紫杉醇、多 西紫杉醇、喜树等价格昂贵且水溶性差、生物利用度差的抗肿瘤药物递送系统，作为抗肿瘤 药物新剂型有着广阔的市场前景和潜在的肿瘤临床治疗价值。 附图说明 图1为本发明实施例1的Cy-OA结构的1HNMR谱图和质谱图。 图2为本发明实施例2的HA-Cy-OA结构的1HNMR谱图。 图3为本发明实施例3的DTX/HA-Cy-OA NPs的透视电镜图。 图4为本发明实施例4的DTX/HA-Cy-OA NPs在还原条件下和生理条件下的粒径和 PDI变化图。 图5为本发明实施例5的DTX/HA-Cy-OA NPs的体外释放曲线。 图6为本发明实施例6的MTT法测定DTX/HA-Cy-OA NPs对于MCF-7，MDA-MB-231和 A549细胞的细胞存活率曲线图。 图7为本发明实施例7的DTX/HA-Cy-OA NPs体内药效实验中肿瘤体积生长曲线(V- t)图。 图8为本发明实施例7的DTX/HA-Cy-OA NPs体内药效试验中肿瘤图。 图9为本发明实施例7的DTX/HA-Cy-OA NPs体内药效实验中小鼠体重变化折线(V- t)图。 图10为本发明实施例7的DTX/HA-Cy-OA NPs体内药效实验中小鼠荷瘤率图。
