技术摘要：
本发明属于发酵工程领域，涉及一种提取ARA毛油的方法。具体地，本发明涉及一种提取ARA毛油的方法，包括如下步骤：1)将用于生产ARA的微生物的发酵培养物进行脱水处理；2)将步骤1)的产物进行柔性压榨，得到ARA毛油。本发明的方法制备ARA，产量高，纯度高，并且有利于ARA  全部
背景技术：
ARA，又称花生四烯酸，全名二十碳四烯酸(cis－5,8,11,14－arachidonic  acid, ARA)，是ω－6系列的一种多元不饱和脂肪酸。ARA是一种人体重要的必需脂肪酸，也是人体 中含量最高、分布最广的一种多不饱和脂肪酸。ARA在血液、肝脏、肌肉和其他器官系统中作 为磷脂结合的结构脂类起重要作用，ARA是许多循环二十烷酸衍生物的直接前体。这些生物 活性物质对脂质蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要 的调节作用。此外，有研究表明，ARA降血脂、降血压和降血胆固醇的效果均强于亚油酸和亚 麻酸；同时能缓解氯化钡、乌头碱等引起的心律不齐，其作用效果也强于亚油酸和亚麻酸。 因此，ARA具有重要的营养、保健和医疗功能。 目前，ARA主要由微生物发酵法生产。公开号为CN105112466A的专利公开了一种添 加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其所公开的添加产物促进剂的摇瓶在培养结束 后检测发酵液中ARA含量为5.41g/L，产量较对照提高了45.1％。公开号为CN102925502A的 专利公开了一种利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其所公开的产量为花生 四烯酸的单位产量达到10g/L发酵液。公开号为CN104278107A的专利公开了一种基于溶氧 调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其所公开的产量为25m3发酵罐发酵高山被 孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸占总油脂的百分含量、花生四烯酸的单位产量分别可 以达到55g/L、54％、65％、20.628g/L，花生四烯酸生产强度达到1.753g/(L·d)，这也是目 前报道的采用高山被孢霉大规模工业化生产ARA的最高生产水平。虽然其ARA生产率较之前 的研究有了较大提高，但对于利用高山被孢霉进行工业化生产花生四烯酸，大大降低其生 产成本，提高单位产量，使微生物发酵工业化生产ARA的方法能够得到大力推广和普及使用 还是远远不够的。 现有从高山被孢霉发酵培养物中提取ARA的方法主要有三种，一是离心法，二是有 机溶剂萃取法，三是超临界萃取法。离心法如公告号为CN1282745C的专利公开了一种从微 生物细胞中获得油的方法，所述的油包含一种或多种不饱和脂肪酸，该方法包括：(a)裂解 微生物细胞的细胞壁以释放出油来；和(b)通过离心从至少部分(a)中所形成的细胞壁碎片 中分离油。但该发明离心后的油层品质较差，除含油脂外，还含有水分、培养基成分和细胞 碎片，不利于后续的精炼，另外离心后的废水层含有大量菌渣，COD很高，难以处理或处理成 本极高。有机溶剂萃取法如公告号为CN101109015B的专利公开了一种花生四烯酸油脂的制 备方法，其中所述的油脂提取方法为：将老化后的菌体收集、烘干、磨碎，用石油醚和乙醇萃 4 CN 111575323 A 说　明　书 2/19 页 取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到花生四烯酸油脂。但该方法使用到 有机溶剂进行萃取，最终产品可能会有溶剂残留，且萃取过程存在易燃易爆等安全隐患。超 临界萃取方法如公开号为CN101579019A的专利公开了一种用CO2超临界萃取法提取多不饱 和脂肪酸油脂的方法，其步骤如下：①粉碎过筛；②加温萃取；③将液态CO2注入萃取釜中， 加压；④萃取完毕收集油脂。但超临界设备价格昂贵，萃取收率也不高，该发明萃取出油率 最高只有50％。 现有技术中ARA毛油的精炼多采用化学精炼技术，ARA毛油经过脱胶、碱炼、脱色、 脱臭后得到ARA精油。该工艺技术不可避免地存在一些问题，如：碱炼为了达到控制酸价低 的要求，通常都会加入过量碱，部分甘油三酯不可避免会被皂化；碱炼产生的高COD废水会 污染环境；碱炼需要高温处理时间长，容易造成产品过氧化值、茴香胺值升高；脱臭温度高、 时间长易产生反式脂肪酸等缺点。 目前，尚需要开发新的ARA生产工艺。
技术实现要素：
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种培养用于生产ARA的微生 物的方法。本发明人惊奇地发现，所述培养方法能够大幅度地提高生物量及ARA产量。进一 步地，本发明人还发现了一种提取ARA毛油的方法，所述提取方法能够提高ARA毛油的提取 收率和品质。进一步地，本发明人还发现了一种纯化ARA毛油的方法，其能够提升ARA成品油 的各项技术指标和纯化收率。本发明显著地提高了含ARA的粗油脂产量、ARA产量以及ARA生 产率。由此提供了下述发明： 本发明的一个方面涉及一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中： 从发酵罐培养的100－140小时开始，将发酵温度保持在20－25℃(例如21－25℃、 20－24℃、21－23℃、22－25℃、22－24℃、23－25℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃)； 优选地，直至发酵结束； 和/或 从发酵罐培养的第8－10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上(例如55％ 以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以 上)；优选地，直至发酵结束。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中： 从发酵罐培养的105－135小时、110－130小时、115－125小时(例如115、116、117、 118、119、120、121、122、123、124或125小时)或者120小时开始，将发酵温度控制在20－25℃ (例如21－25℃、20－24℃、21－23℃、22－25℃、22－24℃、23－25℃、20℃、21℃、22℃、23 ℃、24℃或25℃)，和/或 从发酵罐培养的第8天、第9天或者第10天开始，停止通气或者将通气量减少50％ 以上(例如55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％ 以上或95％以上)。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，在保持发酵温度为20－25℃ 之前，发酵温度为25－30℃(例如26－30℃、25－29℃、26－28℃、27－30℃、26－29℃、28－ 30℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)。 5 CN 111575323 A 说　明　书 3/19 页 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，所述发酵液的pH为6.0－ 7.0； 优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，发酵液中葡萄糖的浓度保 持1－5g/L(例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5g/L)。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，在停止通气或者将通气量减 少50％以上的同时或之后，发酵液中葡萄糖的浓度1－2g/L； 优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵温度20－25 ℃； 优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，停止搅拌； 优选地，将上述3个条件即葡萄糖浓度、发酵温度、停止搅拌，保持至发酵结束； 优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，滤去发酵液，并加入适量水 或新鲜的发酵培养基。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养还包括在发 酵罐培养起始的36－60小时(例如40－56小时、42－54小时、44－52小时、46－50小时、46、 47、48、49或50小时)，进行分罐培养的步骤；例如，分为两个或更多个发酵罐进行发酵罐培 养。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其在发酵罐培养之前，还包括接种 和种子扩大培养的步骤； 优选地，所述种子扩大培养包括一级种子扩大培养和二级种子扩大培养； 优选地，所述一级种子扩大培养包括下述步骤： 按照0.4％－1％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中， 培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养30－35h，完成一级种子扩大 培养； 优选地，所述二级种子扩大培养包括下述步骤： 按照1％－3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种 子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养20－25h，完成二级 种子扩大培养。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，还包括在接种和种子扩大培养之 前，进行活化培养的步骤；优选地，所述活化培养的温度为25－32℃，搅拌转速100－ 200rpm，时间为40－48h。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养包括下述步 骤： 按照1％－3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐 中，培养温度20－30℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，搅拌转速0－50rpm，进行发酵 罐培养。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中用于生产ARA的微生物为高山 被孢霉或其突变菌株；所述高山被孢霉可以是本领域已知的高山被孢霉，例如，所述高山被 孢霉选自保藏号为CCTCC  No.M2012073、CCTCC  No.M2013392、CCTCC  No.M2015421和ATCC  No.42430的菌株。 6 CN 111575323 A 说　明　书 4/19 页 在本发明一个具体的实施方式中，所述的培养方法，包括下述步骤： 1)将高山被孢霉(Mortierella  alpine)斜面保藏菌株接入装有400mL培养基的2L 摇瓶，在25－32℃的温度下以150rpm的转速培养40－48h，完成菌株活化培养； 2)按照0.4％－1％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐 中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养30－35h，完成一级种子 扩大培养； 3)按照1％－3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级 种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养20－25h，完成二 级种子扩大培养； 4)按照1％－3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵 罐中，培养温度20－30℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，搅拌转速0－50rpm，进行发 酵培养； 5)将120h前的罐温控制在25－30℃、120h及之后的罐温控制在20－25℃； 6)发酵至48h将发酵罐中发酵液一分为二培养，一半发酵液留在主罐中继续培养， 另一半发酵液通过压差法转移至无菌保压的副罐中培养，主副罐中分别补入适量灭菌后新 鲜培养基或无菌水，分罐培养后主副罐通气量、罐压及搅拌转速均稍作调整； 7)发酵过程中葡萄糖浓度随菌体生长不断下降，流加碳源将发酵液中糖点(葡萄 糖浓度)维持在1－5g/L； 8)发酵培养8－10d，中止发酵，主副罐均通过放料管路筛网过滤，得到的菌体重新 加入等体积一次水，稍开搅拌将菌体重悬后，停搅拌，停止通气，维持罐温20－25℃，流加碳 源控制主副罐糖点在1－2g/L，静置1－2d； 不拘于理论的限制，步骤8)可以刺激高山被孢霉菌体中短链及低碳脂肪酸往ARA 转化积累，提高菌体中ARA含量； 9)放罐，测定发酵液中生物量达50－60g/L，粗油脂含量达50％－65％，ARA占总油 脂含量为55％－60％，ARA产量最高可达20.1g/L，ARA产率最高可达1.83g/(L·d)。 上述步骤7)中，糖点(葡萄糖的浓度)采用本领域技术人员知悉的方法测定，例如 生物传感仪测定。 在本发明的一个实施方案中，所述的培养方法，其中所用的发酵培养基碳源中添 加20％－40％(粗甘油的质量/碳源的质量×100％)预处理后的生物柴油副产物粗甘油。生 物柴油是以植物油和动物油脂等可再生油脂为原料制成的可再生能源，经过转酯反应后可 生成生物柴油及副产物甘油。粗甘油的预处理过程包括调节pH值至酸性、稀释、水解、分离。 在本发明的一个实施方案中，粗甘油的预处理包括下述步骤：i)将粗甘油与去离子水以1:4 (体积比)混合；ii)以盐酸调节pH至6.5左右；iii)以5000rpm的转速分离去除沉淀物质。不 拘于理论的限制：步骤i)中，稀释后可以降低粘度；步骤ii)中，将粗甘油中可溶性的皂角类 物质转化为不溶的游离脂肪酸固体物质；步骤iii)中，沉淀物质包括游离脂肪酸固体和不 溶解的重金属杂质。 上述种子培养基可以采用本领域培养已有的菌种高山被孢霉(Mortierella  alpine)种子培养基。上述发酵培养基可以采用本领域培养已有的菌种高山被孢霉 (Mortierella  alpine)发酵培养基。 7 CN 111575323 A 说　明　书 5/19 页 上述发酵培养基中碳源包括葡萄糖、玉米浆粉、糖蜜、甘油和淀粉中的一种或多 种；氮源包括大豆粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、硝酸钠、谷氨酸钠、硫酸铵中的一种或多种。 上述发酵培养基中添加的微量元素包括丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、泛酸钙、生物素、 维生素B1、微生物B6、微生物B12、维生素K中的一种或多种，当为其中一种时，添加量为 0.001％－0.01％；当为其中多种时，任意一种组分的添加量为0.001％－0.005％。 上述发酵培养基中添加的无机盐包括硫酸镁、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢 钾、磷酸氢二钾中的一种或多种。 本发明的另一方面涉及一种微生物的发酵培养物，其由本发明中任一项所述的培 养方法得到。 本发明的再一方面涉及一种提取ARA毛油的方法，包括如下步骤： 1)将用于生产ARA的微生物的发酵培养物进行脱水处理； 2)将步骤1)的产物进行柔性压榨，得到ARA毛油。 在本发明的一个实施方案中，所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述发酵培养物 为高山被孢霉发酵培养物；优选地，所述发酵培养物为本发明的发酵培养物。 在本发明的一个实施方案中，所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述脱水处理选 自如下的任意一种、两种或三种： 离心或板框过滤、第一级柔性压榨、干燥例如气流干燥； 优选地，所述脱水处理依次包括离心和第一级柔性压榨，或者依次包括板框过滤 和气流干燥； 优选地，所述气流干燥的进风温度110－150℃，出风温度30－70℃，至水分含量小 于10％。 在本发明的一个实施方案中，所述的提取方法，其中，步骤1)中，所述第一级柔性 压榨采用逐步加压方式，设定压力为20－40MPa，加压时间为1－6h，到达设定压力后保压 1－4h。 在本发明的一个实施方案中，所述的提取方法，其中，步骤2)中，所述柔性压榨采 用逐步加压方式，设定压力为50－150MPa，加压时间为1－6h，到达设定压力后保压1－4h。 在本发明一个具体的实施方式中，所述的提取方法，包括下述步骤： 1)布料：将一定量的发酵培养物用布料器运送至布料腔中，布料器回到初始位置， 待下一步布料。 2)一级柔性压榨：采用逐步加压方式，一级柔性压榨的压力范围为20－40MPa，加 压时间约为1－6h，到达设定压力，保压1－4h至基本无水滴流出，结束后，待物料下降到重 压腔中，将物料推入二级柔性压榨位置。 3)二级柔性压榨：采用逐步加压方式，压榨的最终压力为50－150MPa，加压时间大 约为1－6h，到达设定压力，保压1－4h至基本无油滴流出，收集压榨出来的ARA毛油，卸压， 去掉二级压榨笼，将菌渣与滤布进行分离。 上述ARA发酵液可直接进行一级柔性压榨，也可以先采用离心方法除去一部分水 分，提高发酵液的含固量后再进行一级柔性压榨，可缩短压榨时间和提高生产能力。 上述发酵液离心方法可采用卧式螺旋离心机、碟式离心机、管式离心机中的一种 进行。 8 CN 111575323 A 说　明　书 6/19 页 在本发明另一个具体的实施方式中，所述的提取方法，包括下述步骤：发酵培养物 经板框过滤、气流干燥得到菌粉，菌粉进行柔性压榨，得到ARA毛油。 上述板框过滤方式为：发酵液进料后，过滤至压滤机滤嘴全开且进料压力达到 0.6－1.0MPa，过滤完毕后吹气，吹气压力0.3－0.6MPa，吹气时间1－3h。 上述气流干燥进风温度110－150℃，出风温度30－70℃，ARA菌粉水分控制在10％ 以内。 本发明的再一方面涉及一种ARA毛油，其由本发明中任一项所述的提取方法制得。 本发明的再一方面涉及一种纯化ARA毛油的方法，包括将ARA毛油进行水化、脱色 和分子蒸馏的步骤；优选地，所述ARA毛油为本发明的ARA毛油。 在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中，所述水化包括如下步骤： 将ARA毛油加热至70－85℃，按1kg毛油加入50－150g水的比例加入75－90℃水， 搅拌10－60min，搅拌速度30－90转/min，静置1－6h，分层去掉下层磷脂，得到水化油。 在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中，所述脱色包括如下步骤： 将水化产物升温至90－110℃，控制真空度≤-0.07MPa，真空脱水0.5－2h，然后降 温至60－80℃，加入脱色剂(例如水化油重量1％－3％的活性炭和2％－4％活性白土)，搅 拌0.5－1h，停止搅拌，过滤去除脱色剂，得到脱色油。 在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中，所述分子蒸馏为三级分子蒸 馏； 优选地，所述分子蒸馏包括如下步骤： 将脱色油进入三级分子蒸馏，控制第一级真空度≤100Pa、温度150－200℃，去除 第一级的轻组分；得到的第一重组分进入第二级分子蒸馏，控制二级真空度≤50Pa、温度 180－220℃，去除第二级轻组分；得到的第二重组分进入第三级分子蒸馏，控制第三级真空 度≤5Pa、温度200－250℃，去除第三级轻组分，得到第三重组分，为ARA成品油。 优选地，重复分子蒸馏1次或多次(例如2、3、4或5次)。 在本发明一个具体的实施方式中，所述的纯化方法，包括下述步骤： 1)水化：ARA毛油加热至70－85℃，按1kg毛油加入50－150g纯化水的比例加入 75－90℃纯化水，搅拌10－60min，搅拌速度30－90转/min，静置1－6h，分层去掉下层磷脂， 得到水化油； 2)脱色：水化油移入脱色锅，升温至90－110℃，控制真空度≤－0.07MPa，真空脱 水0.5－2h，然后降温至60－80℃，加入脱色剂(水化油重量1％－3％的活性炭和2％－4％ 活性白土)，搅拌脱色0.5－1h，停止搅拌，过滤去除脱色剂，得到脱色油； 3)分子蒸馏：脱色油进入三级分子蒸馏，控制第一级真空度≤100Pa、温度150－ 200℃，去除第一级的轻组分，重组分进入第二级分子蒸馏，控制二级真空度≤50Pa、温度 180－220℃，去除第二级轻组分，重组分进入第三级分子蒸馏，控制第三级真空度≤5Pa、温 度200－250℃，去除第三级轻组分，收集重组分，得到分子蒸馏油。分子蒸馏遍数控制1－3 遍，至酸价、气味符合标准要求。分子蒸馏完毕，降温至20－40℃，添加抗氧化剂，包装，得到 ARA成品油。 本发明的再一方面涉及一种ARA成品油，其由本发明中任一项所述的纯化方法制 得。 9 CN 111575323 A 说　明　书 7/19 页 本发明的再一方面涉及一种利用微生物生产ARA或含有ARA的产品(例如ARA成品 油)的方法，包括： 本发明任一项所述的培养用于生产ARA的微生物的方法、 本发明任一项所述的提取ARA毛油的方法、和/或 本发明任一项所述的纯化ARA毛油的方法。 在本发明的一个实施方式中，生产ARA成品油的工艺流程如图1所示。 在本发明的另一个实施方式中，生产ARA成品油的工艺流程如图2所示。 本发明中， 术语“柔性压榨”是指采用PLC(可编程逻辑控制器)程序控制来进行加压－保压－ 加压循环，逐步达到预定压力的一种高压压榨方式。 术语“纯化水”是指饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制 得的供药用的水，不含任何添加剂。在本发明的一个实施方案中，所述纯化水参照《中国药 典》的规定。 术语“ARA毛油”是指，从ARA发酵液中制取、没经过精炼加工的初级油。 术语“ARA成品油”是指，ARA毛油经过精炼加工得到的精油。 术语“发酵罐培养”是指种子扩大培养之后，在发酵罐中进行的用于生产目的产物 的发酵培养。 本发明中，当提及“通气”或“通气量”时，如果没有特别说明，是指通入空气或者通 入空气的量。 发明的有益效果 本发明具有下述技术效果中的至少一种： (1)本发明的工艺技术指标均明显优于现有的工艺技术指标，所得ARA油脂产量 高、纯度高，有利于ARA的大规模工业化生产，粗甘油的添加也降低了ARA发酵生产成本，大 大提高了ARA发酵生产的市场竞争力。 (2)本发明采用柔性压榨工艺制备ARA毛油，不需要使用有机溶剂进行提取，整条 生产工艺路线无需使用有机溶剂，最终产品不会有溶剂残留，一方面所得产品绿色健康，产 品质量好，另一方面生产车间安全环保，是一个绿色的清洁生产工艺。 (3)发酵培养物经一级柔性压榨除去的水溶液，基本不含菌渣，COD比较低，容易生 化处理，二级柔性压榨得到毛油后，剩下的菌渣还含有少量的油脂和大量的蛋白，可以作为 饲料添加剂使用，经济环保。 (4)本发明采用分子蒸馏一步工艺替代传统脱酸、脱臭两步工艺。分子蒸馏能够在 保留物质生理活性的基础上快速去除大量的游离脂肪酸和臭味。对比传统的碱炼脱酸方 法，分子蒸馏脱酸工艺简单，降低了过度碱炼的风险，减少从皂脚带走中性油脂的损失，脱 酸收率明显提高，脱酸过程在高真空条件下进行且时间短，避免了碱炼脱酸受热时间长造 成过氧化值、茴香胺值升高的风险，产品稳定性好；对比传统水蒸气蒸馏脱臭工艺，分子蒸 馏脱臭时间短，真空度高，减少了反式脂肪酸的产生，且臭味物质脱除效果好，产品无腥味。 (5)生产过程避免了有机溶剂的使用，避免了溶剂消耗和溶剂回收的成本，污水 COD低容易处理，精炼收率高，从而大大降低了生产成本。 10 CN 111575323 A 说　明　书 8/19 页 附图说明 图1：本发明一个实施方式的生产ARA成品油的工艺流程示意图。 图2：本发明另一个实施方式的生产ARA成品油的工艺流程示意图。 图3：所公开的高山被孢霉Mortierella  alpine在不同培养方式下100m3发酵罐发 酵生产ARA的结果。