技术摘要：
本发明涉及一种维生素B2片中有关物质的分析方法，以磷酸二氢钠溶液和甲醇与乙腈的体积比为3:7的混合溶液作为混合流动相进行梯度洗脱。所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为93～97:7～3。采用本发明的检测方法，专属性高，灵敏度高，回收率高，检出的杂质多  全部
背景技术：
维生素B2是体内黄酶类辅基的组成部分，(黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作 用)，当缺乏时可影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍，其病变多表现为口、眼、外生殖器 部位的炎症。用于预防和治疗维生素B2缺乏症，如口角炎、唇干裂、舌炎、阴囊炎、结膜炎、脂 溢性皮炎等。 为了保证药物的安全有效，需要对药物中的有关物质进行研究、检测和监控。有关 物质主要为工艺副产物及降解产物，药品在放置过程中，杂质在发生变化，因此需要根据不 同的合成路线和生产工艺、贮藏条件建立合适的分析方法，达到对维生素B2有关物质准确、 有效的检测和监控。
技术实现要素：
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种维生素B2中有关物质的检测方 法。 本发明的技术方案如下： 一种维生素B2有关物质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱对维生素B2 及有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动 相进行梯度洗脱，所述流动相A为磷酸二氢钠溶液，所述流动相B为甲醇与乙腈的体积比为 3:7的混合溶液；所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为93～97:7～3；所述 梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-1分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持初始比例不变； (2)在1-16分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至85:15；(3)在16-35 分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变；(4)在35-45分钟内，流动相A和流动相 B的体积比由85:15匀速渐变至70:30；(5)在45-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持 70:30不变；(6)在55-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至30:70；(7) 在60-65分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(8)在65-66分钟内，流动相A 和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至初始比例；(9)在66-70分钟内，流动相A和流动相B 的体积比保持初始比例不变。 本发明的检测方法可用于检测维生素B2原料药、维生素B2片剂中的维生素B2及有 关物质。 在一种优选的方案中，当流动相A和流动相B的初始比例为95:5时，所述梯度洗脱 包括以下步骤：(1)在0-1分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；(2)在1-16分 钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至85:15；(3)在16-35分钟内，流动相A和 流动相B的体积比保持85:15不变；(4)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15 4 CN 111595961 A 说　明　书 2/19 页 匀速渐变至70:30；(5)在45-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；(6)在 55-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至30:70；(7)在60-65分钟内， 流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(8)在65-66分钟内，流动相A和流动相B的体积 比由30:70匀速渐变至95:5；(9)在66-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5。具 体的梯度洗脱过程如下所示： 本发明采用高效液相色谱法检测时，采用流动相A(磷酸二氢钠溶液)与流动相B (甲醇与乙腈的体积比为3:7的混合溶液)作为混合流动相进行梯度洗脱，在不影响本发明 效果的情况下，磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L；优选为 0.01mol/L。 本发明中提到的流动相A的制备可包括以下步骤：将磷酸二氢钠以水溶解并稀释 成浓度为0.01mol/L，即得。 本发明中提到的流动相B的制备可包括以下步骤：将甲醇300ml与乙腈700ml混匀 即可。 本发明溶解待测样品(例如，维生素B2片剂)采用的溶剂为盐酸水溶液。例如，10％ 盐酸水溶液、30％盐酸水溶液、40％盐酸水溶液、50％盐酸水溶液、60％盐酸水溶液或80％ 盐酸水溶液。 本发明采用高效液相色谱法检测时，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。 在不影响检测效果的情况下，优选色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。例 如：YMC-PACK  ODS-AQ(4.6*250mm，5μm)或Inertsustain  C18(4.6*250mm，5μm)。 进一步的，高效液相色谱条件包括：检测波长为258nm～268nm，优选267nm。 进一步的，柱温为25℃～35℃，优选为30℃。 进一步的，流速为0.8～1.5ml/min，优选为1.0ml/min。 本发明可以根据需要，选择合适的进样量进样，进样量为80～100μl；优选100μl。 例如：进样量为80μl、90μl或100μl。 本发明提及的维生素B2有关物质， 采用本发明的技术方案，优势如下:包括以下物质：杂质A：7,8,10-三甲基-3,10- 二氢苯并碟啶-2,4-二酮；杂质B：7,8-二甲基-1,3-二氢苯并碟啶-2,4-二酮；杂质C：6,7-二 甲基-8-((2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基)蝶啶-2,4-二酮；杂质D：8-羟甲基-7-甲基-10- [(2S,3S,4R)-2,3,4,5四羟基戊基]-3,10二氢苯并碟啶-2,4，-二酮。具体如下所示： 5 CN 111595961 A 说　明　书 3/19 页 本发明采用高效液相色谱法，分别从色谱条件等方面进行筛选、优化，拟定有关物 质的检测方法，进行方法学验证，对杂质A、杂质B、杂质C和杂质D进行了定量研究，并提供完 整的验证方案，操作简单，稳定性和重现性良好。其中，杂质A的校正因子为0.7；杂质B的校 正因子为1.0；杂质C的校正因子为2.4；杂质D的校正因子为1.1。 溶解杂质A或杂质B包括如下步骤：以冰乙酸溶解杂质A或杂质B后，再以水定容及 稀释；溶解杂质C或杂质D包括如下步骤：以混合流动相溶解杂质C或杂质D后，再定容及稀 释，优选地，混合流动相中流动相A和流动相B的体积比为9:1。 本发明提供的检测方法的具体步骤为：分别配制杂质定位溶液、对照品溶液、供试 品溶液并进样，通过加校正因子的主成分自身对照法进行杂质含量检测。 本发明采用高效液相色谱法，可以配制如下样品溶液： 供试品溶液：取本品细粉适量(约相当于维生素B2片10mg)精密称定，置100ml量瓶 中，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释 至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。 对照品溶液：0.1％供试品溶液。(稀释剂:水) 6 CN 111595961 A 说　明　书 4/19 页 杂质定位溶液：称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg分别置10ml量瓶中，加溶剂 (流动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解并稀释至刻度，作为杂质C与杂质D定位母液溶液； 另精密称取杂质A对照品、杂质B对照品1mg分别置100ml量瓶中，加冰乙酸(3ml)溶解后用水 稀释至刻度，摇匀，作为杂质A与杂质B定位母液溶液；取各个杂质母液加水制成每1ml中含 有对照品A0.03μg、B  0.2μg、C  0.2μg、D  0.2μg的混合溶液，作为混合定位溶液。 本发明通过筛选合适的流动相并优化流动相中各组分比例，选择合适的供试品溶 剂、杂质定位用溶剂，筛选合适的其他色谱条件，对维生素B2及有关杂质进行色谱分析，确 定了本发明的分析方法，进行了专属性(杂质与主成分分离度实验、强制降解实验)、重复 性、精密度、准确的、线性范围、校正因子、耐用性验证，确证方法的可行性。 采用本发明的技术方案，优势如下: 本发明提供的维生素B2有关物质的检测方法，克服了维生素B2在稀碱中易溶但不 稳定，而在水、乙醇、三氯甲烷或乙醚等溶剂中几乎不溶，导致的待测液难以配制的难题，在 现有技术的基础上，通过筛选合适的流动相并优化流动相中各组分比例，以盐酸水溶液作 为供试品溶剂，并优化杂质定位用溶剂，提高了待测样品的稳定性；在确保完全溶解的情况 下，以较低浓度的待测液进行色谱分析，灵敏度高、特异性强、重现性好，能够准确的分离已 知及相关未知杂质，满足维生素B2片有关物质的检测要求，可用于维生素B2片的质量控制。 附图说明 图1是杂质C以0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解色谱图； 图2是杂质B以0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解色谱图； 图3是杂质B以冰乙酸溶解色谱图； 图4是杂质C以流动相A:流动相B的体积比为9:1溶液溶解色谱图； 图5是空白辅料色谱图； 图6是本发明杂质混合溶液定位色谱图； 图7是本发明供试品溶液检测色谱图； 图8是EP9.0供试品溶液检测色谱图； 图9是《中国药典》供试品溶液检测色谱图； 图10是杂质A线性图； 图11是杂质B线性图； 图12是杂质C线性图； 图13是杂质D线性图； 图14是维生素B2线性图。