技术摘要：
本发明属于PLTP过表达模型构建技术领域，公开了一种脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法及测定方法，10月龄3×Tg‑AD雄鼠，随机分为模型组，实验组，以同月龄具有相同遗传背景的雄性C57BL/6J作为对照组；AD模型注射携带PLTP基因增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒A  全部
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer’s  disease，AD)是中枢神经系统退行性疾病，是痴呆最 常见的类型。目前对于AD的研究国内外学者广泛关注，提出了多个致病机制学说，并研制出 了有一定治疗效果的针对性药物，但其发病机制仍未完全阐明，尚缺少有效的治疗药物。磷 脂转运蛋白(phospholipid  transfer  protein，PLTP)是一种广泛表达于中枢神经系统的 糖蛋白，近年，体内、外研究发现，PLTP与AD密切相关。PLTP缺乏可促进老年小鼠认知功能的 下降，那么PLTP高表达是否对AD具有改善作用，国内外研究还未见报道。多种方式可用于研 究PLTP过表达对AD的影响，如给与重组的PLTP蛋白，但重组的蛋白价格昂贵，而且动物给药 还要考虑药物是否能被吸收进入机体，能否透过血脑屏障进入脑组织发挥作用等，因此利 用病毒作为载体，脑定位注射后，诱导PLTP基因高表达，进而引起PLTP蛋白表达上调是较为 理想的技术，利用这种技术，再结合APP/PS1/Tau三转基因的AD小鼠，可以整体水平明确 PLTP高表达对AD的保护作用。AD虽然是危害人类的重要疾病，但目前还未有完全能模拟人 类AD的动物模型，这给AD机制及药物开发的研究带来了困难。而APP/PS1/Tau三转基因的AD 小鼠目前是众多模型中相对较好的一种AD的模型，通过此模型对PLTP高表达的AD保护作用 研究，能更加确证PLTP的抗AD作用。另外，Aβ与Tau都是AD发病过程中的关键分子，而PLTP高 表达对两种分子都具有调控作用，也说明其有望成为临床抗AD的成分或靶点之一。而通过 病毒介导的基因治疗在肿瘤治疗中已有应用，也时通过病毒介导基因表达的AD治疗具有一 定可能性。 通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：PLTP缺乏可促进老年小鼠认知功 能的下降，PLTP高表达是否对AD具有改善作用，国内外研究还未见报道。 解决以上问题及缺陷的难度为：侧脑室定位注射，腺相关病毒PLTP高表达基因的 构建。 解决以上问题及缺陷的意义为：为临床以PLTP为靶点的AD治疗提供依据。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种脑组织特异性PLTP过表达模型构建 方法及测定方法。 本发明是这样实现的，一种脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法，所述脑组织 特异性PLTP过表达模型构建方法包括： 第一步，以3×Tg-AD小鼠作为AD模型，10月龄3×Tg-AD雄鼠，随机分为模型组，实 验组，以同月龄具有相同遗传背景的雄性C57BL/6J作为对照组； 第二步，AD模型注射携带PLTP基因增强型绿色荧光蛋白报告基因的腺相关病毒 4 CN 111593071 A 说　明　书 2/6 页 AAV-PLTP-EGFP，诱导PLTP的高表达； 第三步，对照组与模型组均注射不携带PLTP基因只携带增强型绿色荧光蛋白报告 基因的腺相关病毒AAV-EGFP。 进一步，所述脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法10月龄3×Tg-AD雄鼠24只， 随机分为模型组12只，实验组12只。 进一步，所述脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法以同月龄具有相同遗传背景 的雄性C57BL/6J作为对照组12只。 本发明的另一目的在于提供一种由所述脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法 构建的脑组织特异性PLTP过表达模型。 本发明的另一目的在于提供一种所述脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法， 所述脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法包括： 第一步，以3×Tg-AD小鼠作为AD模型，构建脑组织特异性PLTP过表达模型；诱导 PLTP基因的高表达。 第二步，观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的影响；AD主要的临床表 现就是认知功能下降，水迷宫等方法可检测动物的认知功能评价PLTP高表达的抗AD作用。 第三步，病理学观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠的保护作用；老年斑和神经纤维 缠结时AD特征性的病理学改变，因此病理学观察可以确证PLTP高表达的抗AD作用。 第四步，观察PLTP过表达对Aβ及其生成相关蛋白的影响；Aβ与Tau是AD发病的关键 分子，通过两个通路蛋白的检测，明确PLTP改善AD的可能通路。 第五步，观察PLTP过表达对总Tau蛋白及其pTau蛋白的影响；Aβ与Tau是AD发病的 关键分子，通过两个通路蛋白的检测，明确PLTP改善AD的可能通路。 第六步，观察PLTP过表达对GSK-3β及GSK-3β的影响；采用western  blot检测GSK-3 β及GSK-3β的蛋白表达水平。GSK3β既可以调控Aβ，也可以调控Tau，有文献报道PLTP可调控 GSK3β的活性，通过对GSK3β的检测明确PLTP抗AD作用的机制。 进一步，所述第二步观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的影响；小鼠 侧脑室注射AAV-PLTP-EGFP病毒2周后，水迷宫实验与穿梭被动回避实验检测小鼠的学习记 忆能力；水迷宫实验分为定位航行实验和空间探索实验两部分，以小鼠寻找平台的潜伏期、 进入平台的次数为指标评价认知功能；穿梭被动回避实验在明暗穿梭箱中进行，以小鼠进 入暗箱的潜伏期及在暗箱中的停留时间为指标，评价学习记忆能力。 进一步，所述第三步病理学观察PLTP过表达对3×Tg-AD小鼠的保护作用；通过HE 染色与尼氏染色检测各组病理学损伤，通过Aβ1-42免疫组化染色观察各组老年斑SP的变 化，通过Bielschowsky银染观察各组神经纤维缠结NFT的变化。 进一步，所述第四步观察PLTP过表达对Aβ及其生成相关蛋白的影响；行为学实验 后，处死小鼠，分离小鼠大脑皮质及海马，制备其组织匀浆，采用蛋白免疫印迹技术检测与A β生成相关蛋白APP、PS1、BACE1的表达水平；ELISA法检测Aβ1-40及Aβ1-42水平。 进一步，所述第五步观察PLTP过表达对总Tau蛋白及其pTau蛋白的影响；采用 western  blot检测大脑皮质及海马总Tau蛋白及pTau蛋白在pSer199、pSer214、pThr231、 pSer404四个磷酸化位点的蛋白的表达。 进一步，所述脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法的数据用SPSS16.0软件进 5 CN 111593071 A 说　明　书 3/6 页 行统计，多组样本间比较采用单因素方差分析ANOVO，P<0.05时具有统计学差异。 结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明以3×Tg- AD(即APPSwe/PS1dE91/TauP301L三重转基因)小鼠作为AD模型，以腺病毒介导PLTP基因侧 脑室内转染构建脑组织特异性PLTP过表达模型，采用水迷宫、穿梭被动回避实验、病理学染 色、western  blot等技术和方法，通过学习记忆能力、老年斑、Aβ相关蛋白、总Tau蛋白、pTau 蛋白、GSK-3β通路相关蛋白的检测，探讨PLTP过表达对AD的防治作用及可能机制，以期为通 过PLTP寻找AD治疗的新靶点、新思路提供重要依据。 本发明的PLTP过表达可改善3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力；PLTP过表达对3×Tg- AD小鼠学习记忆能力的改善，可能通过促进GSK-3β失活进而减少Aβ产生和Tau蛋白磷酸化 有关。本发明说明PLTP高表达能明显改善AD小鼠学习能力，其机制可能与调控GSK3B表达， 进而影响Aβ和磷酸化tau的形成，进而产生抗AD作用，有望成为AD治疗的新靶点，而通过病 毒介导PLTP基因高表达可能成为一种新的方法。 附图说明 图1是本发明实施例提供的脑组织特异性PLTP过表达模型构建方法流程图。 图2是本发明实施例提供的脑组织特异性PLTP过表达模型的测定方法流程图。 图3是本发明实施例提供的PLTP在各组小鼠大脑皮质及海马的表达(n＝4 ,#P< 0.05，##P<0.01vs.WT；*P<0.05，**P<0.01vs.3×Tg-AD)示意图； 图中：A：PLTP蛋白条带在模型和3×Tg-AD小鼠海马和皮质内的表达；,B：PLTP在模 型和3×Tg-AD小鼠海马和皮质内的表达。 图4是本发明实施例提供的PLTP过表达能改善3×Tg-AD小鼠学习记忆能力(n＝ 12，#P<0.05，##P<0.01vs.WT；*P<0.05，**P<0.01vs.3×Tg-AD)示意图； 图中：A：水迷宫定位航行实验小鼠逃避潜伏期；B：定位航行实验小鼠运行轨迹；C： 水迷宫空间探索实验60秒穿越平台次数及小鼠进入平台所在区域的潜伏期；D：穿梭被动回 避实验小鼠进入暗箱的潜伏期及暗箱停留时间。