技术摘要：
本发明公开了一种促进枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法。本发明通过在枯草芽孢杆菌生长过程中加入大肠杆菌BW25113敲除子ΔhyfA、ΔphnE、ΔpqiB、Δsyd、ΔtfaE、ΔynfO或ΔynjD，可促进枯草芽孢杆菌生物被膜的形成，使其提高1.4‑1.9倍；并且所用的大肠杆菌BW25113敲除  全部
背景技术：
枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于腐败的有机物和土壤等环境中， 对人畜无毒无害，不污染环境，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌对营 养要求比较低、生长快、能产生耐热、抗逆的芽孢，并且可以制成各种剂型，在农业、发酵产 业、饲料行业、水产养殖、水质净化等领域等得到了较好的应用。 而生物被膜是细菌为了适应生存环境而产生的一种细菌聚集体，这种聚集不是简 单的累加，而是存在着代谢方式、基因表达和各种表型的变化以及菌体之间的物质和信号 交换，大自然中包括枯草芽孢杆菌在内的超过95％的细菌都是以细菌生物被膜的形式存 在。刘伟杰等(2014年)指出，枯草芽孢杆菌生物被膜可被用于处理各种废水，生物被膜的形 成可以增强菌体对有毒污染环境的耐受性，提高对废水的处理效果；在植物根系表面形成 生物被膜有助于提高植物抗逆性，抵御植物对病原菌的侵害。实验室培养的枯草芽孢杆菌 可以形成两种生物被膜，一种是固液膜，一种是气液膜，它们的形成可以引发枯草芽孢杆菌 抗药性的提高和其它表型变化，但是陈云等(2010年)利用噬菌体SPP1转导法敲除枯草芽孢 杆菌生物被膜形成主要途径epsA-H、yqxM-sipW-tasA中关键基因epsH和tasA，获得生物膜 缺失突变体RL3852(ΔepsH)、SB505(ΔtasA)、CY41-H(ΔepsH)、CY41-T(ΔtasA)，上述生物 被膜突变体温室防治青枯病的防效率为36.84％、68.63％、21.75％、29.68％，与其野生型 枯草芽孢杆菌菌株的防效相比有显著降低。由此可见，枯草芽孢杆菌生物被膜的形成对于 该菌株生物活性和功能的发挥具有十分重要的作用，但是，在枯草芽孢杆菌各种菌剂的实 际应用中，经常出现菌种的退化和生物被膜形成能力的降低，从而严重影响了枯草芽孢杆 菌各种效能的发挥。因此，迫切需要寻找能提高枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法。
技术实现要素：
本发明针对枯草芽孢杆菌一直以来被作为有益菌在农业、发酵工业和畜牧业等领 域得到了广泛的应用，但由于各种原因导致的枯草芽孢杆菌生物被膜形成量的减少，而导 致该菌株的效能降低，如吸附重金属离子的能力下降等不足；本发明根据以菌促膜的思路， 通过使用大肠杆菌特定基因敲除子的方法来促进枯草芽孢杆菌生物被膜的形成，使其合成 更多的生物被膜生物量。因此，本发明的目的是提供一种促进枯草芽孢杆菌生物被膜形成 的方法。 本发明利用菌株和菌株之间具有各种关系，如拮抗、互惠共生、促进和抑制等；如 以菌治菌，就是利用两个(或者多个)菌株之间的拮抗作用，用一种菌株去抑制或者杀死另 一种菌株；而相应的以菌促膜(即生物被膜)，就是利用菌株之间协同或者互惠等作用用一 个菌株来诱导另一个菌株形成更多的生物被膜；本发明利用上述的调控特定菌株生物被膜 形成的一个行之有效的手段和方法从而实现本发明目的。 3 CN 111548955 A 说　明　书 2/6 页 本发明的促进枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法，其特征在于，向枯草芽孢杆菌 中加入大肠杆菌基因敲除子从而促进枯草芽孢杆菌生物被膜形成，所述的大肠杆菌基因敲 除子为大肠杆菌BW25113敲除子ΔhyfA、ΔphnE、ΔpqiB、Δsyd、ΔtfaE、ΔynfO和ΔynjD中 的至少一种。 优选，所述的加入是通过将所述的大肠杆菌基因敲除子与所述的枯草芽孢杆菌在 液相中接触来进行的。 优选，所述的加入是通过将所述的大肠杆菌基因敲除子与所述的枯草芽孢杆菌混 合来进行的。 优选，所述的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌PY79。 本发明还提供以大肠杆菌BW25113敲除子ΔhyfA、ΔphnE、ΔpqiB、Δsyd、ΔtfaE、 ΔynfO和ΔynjD中的至少一种作为活性成分的菌剂在促进枯草芽孢杆菌生物被膜形成中 的应用。 优选，所述的菌剂，是将大肠杆菌BW25113敲除子ΔhyfA、ΔphnE、ΔpqiB、Δsyd、 ΔtfaE、ΔynfO和ΔynjD中的至少一种接种于LB培养基中，于25℃-37℃培养得到的。 本发明中所使用的大肠杆菌BW25113敲除子，包括：ΔhyfA、ΔphnE、ΔpqiB、Δ syd、ΔtfaE、ΔynfO和ΔynjD，其中ΔhyfA指氢化酶4组分A(Hydrogenase  4component  A) 基因敲除子、ΔphnE指磷酸ABC转运渗透酶蛋白(Phosphonate  ABC  transporter,permease  protein)编码基因敲除子、ΔpqiB指膜间转运蛋白(Intermembrane  transport  protein) 编码基因敲除子、Δsyd指前蛋白转位酶亚单位SecY相互作用蛋白(Preprotein  translocase  subunit  SecY-interacting  protein)编码基因敲除子、ΔtfaE指e14原噬菌 体假定的尾纤维组装蛋白(e14  prophage  putative  tail  fiber  assembly  protein)编码 基因敲除子、ΔynfO指秦原噬菌体蛋白(Qin  prophage  protein)编码基因敲除子、ΔynjD 指ABC转运体ATP结合蛋白(Putative  ABC  transporter  ATP-binding  protein)编码基因 敲除子。上述的这些大肠杆菌BW25113基因敲除子与枯草芽孢杆菌混合，可促进枯草芽孢杆 菌生物被膜的形成，使其生物量提高1.4-1.9倍。 本发明所提到的上述大肠杆菌基因敲除子，全部来自于大肠杆菌BW25113  keio单 基因突变体文库，无需自己通过基因操作获得，可以通过商业渠道购买得到，然后，进行简 单的实验室活化和复壮，即可使用，简单高效。 本发明所述的方法不涉及复杂的基因操作，只要具有基本的微生物学知识，就可 以使用，易于在实际生产中推广使用。 本发明所用的大肠杆菌BW25113敲除子ΔhyfA、ΔphnE、ΔpqiB、Δsyd、ΔtfaE、Δ ynfO、ΔynjD，可以从网址：https://horizondiscovery .com/en/products/gene- modulation/overexpression-reagents/non-mammalian/PIFs/E-coli-Keio-Knockouts上 购买得到；上述的敲除子本申请人也持有，保证自本发明的申请日起20年内向公众提供。 附图说明 图1是大肠杆菌敲除子对枯草芽孢杆菌生物被膜的促进作用。 4 CN 111548955 A 说　明　书 3/6 页