技术摘要：
本发明公开了白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45‑DTR转基因小鼠的构建方法与应用，通过酶切线性化BAC Clone CD45‑DTR，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/C ES细胞，得到插入IRES‑DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞，随后将此BALB/C ES细胞通过囊胚注射法构建插入  全部
背景技术：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的免疫细胞清除动物模型的不足，提 供一种新型可诱导的、选择性清除免疫细胞的小鼠模型的构建方法，CD45是一种特异性表 达于免疫细胞表面的信号分子，所以我们选择CD45作为驱动DTR表达的基因构建转基因小 鼠，这样在免疫细胞中会表达DTR，而不表达的组织中不表达DTR，注射合适剂量的DT就可以 选择性地诱导免疫细胞凋亡。 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，包括以下步 骤： S1 .酶切线性化BAC  Clone  CD45-DTR载体(由本公司构建，具体构建过程见实施 例)，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/C  ES细胞，得到插入IRES-DTR至CD45外显子1 位点的BALB/C  ES细胞； S2.利用插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/C  ES细胞，囊胚注射法构建插 入IRES-DTR至CD45外显子1位点的CD45-DTR转基因小鼠。 进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方 法，所述步骤S1具体包括以下步骤： (1)小鼠胚胎成纤维细胞用MEF培养基培养，经30Grayγ射线灭活处理后作为滋养 层细胞。BALB/C  ES细胞(以下简述为ES细胞)种在滋养层细胞上，用ES培养基培养； (2)电穿孔法将利用PI-SceI酶切线性化的打靶载体BAC  Clone  CD45-DTR转入ES 4 CN 111607614 A 说　明　书 2/9 页 细胞，使BAC  Clone  CD45-DTR整合至基因组中； (3)利用G418阳选，挑选得到插入BAC  Clone  CD45-DTR的BALB/C  ES细胞克隆； (4)提取ES细胞基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。 进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方 法，所述步骤S1中的步骤4具体为： 提取ES细胞基因组DNA为模板，利用序列为SEQ  ID  NO.17的正向引物和序列为SEQ  ID  NO .18的反向引物进行PCR鉴定，插入BAC  Clone  CD45-DTR的ES细胞阳性克隆可见约 4.1kb条带。 进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方 法，所述步骤S2具体包括以下步骤： (1)插入BAC  Clone  CD45-DTRBALB/C  ES细胞注射入C57BL/6J囊胚，再接种到假孕 的KM母鼠子宫中，出生得到毛色为黑色和白色混杂嵌合体小鼠； (2)提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，PCR鉴定。 (3)利用白色占比最高的5只雄性转基因嵌合体小鼠F0与BALB/c雌鼠交配，得到毛 色为白色的小鼠可能为DC  SIGN-DTR转基因杂合小鼠。小白鼠经鼠尾PCR鉴定后得到DC  SIGN-DTR转基因杂合小鼠，即为F1代小鼠，鼠尾PCR鉴定方法同步骤2。 (4)F1代小鼠与C57BL/6J母鼠杂交进行传代、培育，同时对所得的子代小鼠进行鼠 尾PCR鉴定，鉴定方法同步骤2，得到F2代小鼠。按相同方法对小鼠进行传代。 进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方 法，所述步骤S2中的步骤2具体为： 提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，利用序列为SEQ  ID  NO.19的正向引物和序列 为SEQ  ID  NO.20的反向引物作PCR鉴定，带有IRES-DTR的阳性小鼠可见约1.2kb条带。 进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方 法在在研究免疫细胞功能方面的应用。 进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方 法在制备人源化小鼠方面的应用。 进一步的，如上述白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法 建立清除免疫细胞小鼠模型的方法，包括以下步骤:在第1、第2、第4、第7天分别腹腔注射DT (20ng/g)，特异性清除小鼠免疫细胞,建立清除免疫细胞小鼠模型。 进一步的，对上述建立清除免疫细胞小鼠模型的方法的验证方案，所述验证方案 包括以下步骤：获取小鼠组织，制备成单细胞悬液，用Fc  blocker封闭Fc受体后，利用CD45、 F4/80、CD11b流式抗体染色。 进一步的，对上述建立清除免疫细胞小鼠模型的方法的验证方案，具体包括：获取 小鼠表皮，制备成单细胞悬液，用2％FCS-PBS重悬细胞，经Fc  blocker封闭Fc受体后，利用 anti-mouse-CD45流式抗体染色，染色完毕洗去多余抗体，单细胞悬液用流式细胞仪上机检 测。 综合上述技术方案，本发明公开了一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转 基因小鼠的构建方法与应用，至少有以下方面的有益效果： (1)本发明克服了现有免疫细胞清除动物模型的不足，提供了一种能稳定传代的 5 CN 111607614 A 说　明　书 3/9 页 新型可诱导型的、白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠动物模型的制备、使 用和检测方法。 (2)本发明建立了一种高效、安全靶向整合外源基因至小鼠胚胎干细胞基因组 CD45外显子1位点的方法，并证实敲入的外源基因表达正常。 (3)本发明提供了筛选与鉴定阳性细胞株/克隆的方法和应用实例。 (4)本发明提供了利用转基因ES细胞生产和培育转基因小鼠的方法和应用实例。 (5)本发明构建得到的白喉毒素调控清除免疫的CD45-DTR转基因小鼠动物模型， 免疫细胞清除效率达80％-90％，能够较好地清除免疫细胞，且在不用白喉毒素诱导时，免 疫细胞功能不受影响，利用白喉毒素诱导清除免疫细胞时无副反应，提供了一种全新的免 疫细胞清除的原理和方法，提供了一种全新的免疫细胞可诱导清除的动物模型，可以用于 免疫细胞的研究以及形成人源化小鼠。 附图说明 图1：构建靶向小鼠CD45的打靶质粒流程示意图； 图2：携带抗性基因Neomycin的空载体pL451-targeted-empty的质粒结构示意图； 图3：携带外源基因IRES-DTR、抗性基因Neomycin和CD45两侧同源臂的打靶载体 PL451-loxP  IRES-DTR  CD45  3HA  5HA质粒结构示意图； 图4：打靶载体打靶原理示意图； 图5：PCR筛选与鉴定靶向CD45外显子1位点的DC-SIGN  BAC单克隆，正确靶向的单 克隆出现约1.4kb条带； 图6：PCR筛选与鉴定插入CD45-DTR外显子1位点的小鼠胚胎干细胞单克隆，正确插 入的单克隆细胞出现约1.4kb条带； 图7：利用插入CD45-DTR的ES细胞培育CD45-DTR转基因小鼠流程图； 图8：CD45-DTR转基因小鼠(F1)PCR鉴定结果图； 图9：CD45-DTR转基因小鼠腹腔注射DT特异性清除小鼠免疫细胞的流式细胞术检 测敲除效率结果图。
技术实现要素：
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 实施例1 BAC  Clone  CD45-DTR载体的构建。 (1)构建靶向整合外源基因至小鼠CD45外显子1位点的打靶载体,流程如附图1所 示: 从genome .ucsc .edu网站检索并下载获得小鼠CD45基因组序列，结合小鼠CD45 (Genbank  No:NM_001111316.2)序列，确定各外显子和内含子位置及序列。包含整个CD45基 因的BAC  Clone:RP23-180D23从Children’hospotal  Oakland  Research  Institute购买获 得，BAC  DNA利用 HiPure  Plasmid  Filter  Maxiprep  Kit(Invitrogen)制备备 6 CN 111607614 A 说　明　书 4/9 页 用。 PCR扩增得目的基因片段CD45  5’侧同源臂(CD45  5HA)：以RP23-180D23  BAC  DNA 为模板，利用正向引物CD45-5HA-F(KpnI)-ACCACCGGTACCGTGCAAAGTATGCGTTCTTTTCTTTTAG (SEQ  ID  NO.1)，反向引物CD45-5HA-R(SalI)-AACAACGTCGAC  ATCTGGAGATCAGCTGTGCCC(SEQ  ID  NO.2)作PCR扩增5’侧同源臂5HA(SEQ  ID  NO.3)。下划线序列为酶切位点。 表1：PCR反应体系 表2：PCR扩增条件： 将目的基因片段CD45  5HA克隆至带阳性选择标记基因的载体pL451-targeted- empty，载体结构如附图2所示：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利 用AxyPrep  DNA  Gel  Extraction  Kit(Axygen)回收。带Neomycin阳性选择标记的载体 pL451-targeted-empty(counter-Selection  BAC  Modification  Kit,Genebridges)和回 收后的CD45  5HA经KpnI、SalI(NEB)双酶切。酶切的PCR产物经AxyPrep  PCR  Clean-Up  Kit (Axygen)纯化回收，酶切的载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrep  DNA  Gel  Extraction  Kit(Axygen)回收。利用T4  DNA  ligase(NEB)将载体与目的片段连 接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业 公司测序。测序结果显示CD45  5HA插入成功并命名为中间载体pL451-CD45  5HA-PEN。 PCR扩增得目的基因片段IRES和DTR：以pLVX-EF1α-IRES-mCherry质粒(addgene) 为模板，利用正向引物IRES-F(SalI)-ACCACCGTCGACGCCCCTCTCCCTCCCCCC(SEQ  ID  NO.4)， 反向引物IRES-R-CATGGTTGTGGCAAGCTTATCATCGTG(SEQ  ID  NO.5)作PCR扩增基因片段IRES (SEQ  ID  NO .6)；以pIRES-proHB  EGF  WT质粒(addgene)为模板，利用正向引物DTR-F- CACGATGATAAGCTT  GCCACAACCATGAAGCTGCTGCCGTCG(SEQ  ID  NO .7)，反向引物DTR-R (EcoRI)-ACCACCGAATTCTTAGTGGGAATTAGTCATGCCC(SEQ  ID  NO .8)作PCR扩增DTR(SEQ  ID  NO.9)。下划线序列为酶切位点。PCR反应体系见表1，PCR扩增条件见表2。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用AxyPrep  DNA  Gel  Extraction  Kit(Axygen)回收。IRES和DTR进行Overlap  PCR，合成融合基因片段IRES-DTR (SEQ  ID  NO.10)，具体条件如表3和表4： 表3：Overlap  PCR反应体系： 7 CN 111607614 A 说　明　书 5/9 页 表4：Overlap  PCR扩增条:： 将目的基因片段IRES-DTR克隆至中间载体pL451-CD45  5HA-PEN：PCR产物经琼脂 糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用AxyPrep  DNA  Gel  Extraction  Kit(Axygen) 回收。纯化后的IRES-DTR和中间载体pL451-DCSIGN  5HA-PEN分别经SalI、EcoRI(NEB)双酶 切。酶切的PCR产物经AxyPrep  PCR  Clean-Up  Kit(Axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼 脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrep  DNA  Gel  Extraction  Kit(Axygen)回 收。利用T4  DNA  ligase(NEB)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌 落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示IRES-DTR插入成 功并命名为中间载体pL451-CD45  5HA-IRES-DTR-PEN。 PCR扩增目的基因片段CD45  3’侧同源臂(CD45  3HA)：以RP23-180D23  BAC  DNA为 模板，利用正向引物CD45-3HA-F(BamHI)-ACCACCGGATCCACCATGGGTTTGTGGCTCAAAC(SEQ  ID  N O . 1 1 ) ，反 向 引 物 D C - S I G N - 3 H A - R ( N o t I ) - A C C A C C G C G G C C G C  ATCCATCACACGCAACTTTTAAAAATAG(SEQ  ID  NO.12)作PCR扩增3’侧同源臂CD45  3HA(SEQ  ID  NO.13)。下划线序列为酶切位点。PCR反应体系见表1，PCR扩增条件见表2。 将目的基因片段CD45  3HA克隆至中间载体pL451-CD45  5HA-IRES-DTR-PEN：PCR产 物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用AxyPrep  DNA  Gel  Extraction  Kit (Axygen)回收。纯化后的CD45  3HA和中间载体pL451-CD45  5HA-IRES-DTR-PEN分别经 BamHI、(NEB)双酶切。酶切的PCR产物经AxyPrep  PCR  Clean-Up  Kit(Axygen)纯化回收，酶 切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrep  DNA  Gel  Extraction  Kit(Axygen)回收。利用T4  DNA  ligase(NEB)将载体与目的片段连接，接着转 化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测 序结果显示CD45  3HA插入成功并命名为打靶载体PL451-loxP  IRES-DTR  CD45  3HA  5HA，载 体结构见附图3所示，序列如SEQ  ID  NO.14所示。至此靶向整合外源基因至小鼠CD45外显子 8 CN 111607614 A 说　明　书 6/9 页 1位点的打靶质粒构建完成。 利用打靶载体靶向整合外源基因至小鼠CD45  BAC： (2)电穿孔法将pRed/ET转化入包含整个CD45基因的大肠杆菌BAC  Clone  RP23- 180D23：将包含整个CD45基因的大肠杆菌BAC  Clone  RP23-180D23接种于含氯霉素(15μg/ mL)的LB平板，37℃培养16h。挑选1个克隆于有1mL  LB培养基(含15μg/mL氯霉素)的2mL离心 管(盖子上戳一个洞使能够通气)，37℃200rpm培养过夜。取30μL培养过夜的大肠杆菌克隆 于有1.4mL  LB培养基(含15μg/mL氯霉素)的2mL离心管，37℃1000rpm，培养2-3h扩增得对数 期的大肠杆菌。扩增的大肠杆菌2℃11000rpm离心30s，吸弃上清。大肠杆菌沉淀用1mL冰上 预冷的ddH20清洗3遍，最后留下约30μL  ddH2O重悬大肠杆菌，加入1μL  pRed/ET(20ng/μL, counter-Selection  BAC  Modification  Kit(Genebridges,USA))，轻弹混匀，冰上静置。转 移大肠杆菌悬液至冰上预冷的1mm电穿孔管，利用 Electroporator  2510进行 电穿孔，1350V  10μF  600  Ohms，将pRed/ET转化入BAC  Clone  RP23-180D23。用1mL无抗生素 LB培养基重悬大肠杆菌并转移至2mL离心管，30℃1000rpm培养70min使抗性基因表达。 L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达：取100μL转入pRed/ET并诱导抗性基因表达的大肠杆 菌于含四环素(3μg/mL)、氯霉素(15μg/mL)的LB平板，涂布均匀，30℃避光培养16h。挑取1个 单克隆于有1mL  LB培养基(含3μg/mL四环素，15μg/mL氯霉素)的2mL盖子戳洞的离心管，30 ℃200rpm培养过夜。取30μL大肠杆菌于1个有1mL  LB培养基(含3μg/mL四环素，15μg/mL氯霉 素)的2mL盖子戳洞的离心管，30℃1100rpm培养2h，直到OD600大约0.3。加入50μL  L-阿拉伯 糖至终浓度为0.3-0.4％，37℃200rpm培养45-60min，诱导Red/ET表达。 电穿孔法将线性化的打靶载体PL451-loxP  IRES-DTR  CD45  3HA  5HA转化入表达 Red/ET的BAC  Clone  RP23-180D23：表达Red/ET的大肠杆菌进行离心，2℃11000rpm  30s，吸 弃上清。大肠杆菌沉淀用1mL冰上预冷的ddH20清洗3遍，最后留下约30μL  ddH2O重悬大肠杆 菌，加入1-2μl(100-200ng)用NotI(NEB)酶切线性化的打靶载体PL451-loxP  IRES-DTR  CD45  3HA  5HA，轻弹混匀，冰上静置。转移大肠杆菌悬液至冰上预冷的1mm电穿孔管，利用 Electroporator  2510进行电穿孔，1350V  10μF  600  Ohms，将线性化的打靶载 体PL451-loxP  IRES-DTR  CD45  3HA  5HA转化入BAC  Clone  RP23-180D23。用1mL无抗生素LB 培养基重悬大肠杆菌并转移至2mL离心管，30℃1000rpm培养70min使IRES-DTR-PGK-EM7- Neo同源重组插入CD45  BAC，并表达新霉素抗性基因。取100μL大肠杆菌于含四环素(3μg/ mL)、氯霉素(15μg/mL)、新霉素(15μg/mL)的LB平板，涂布均匀，30℃培养大于20h，得到插入 IRES-DTR-PGK-EM7-Neo的大肠杆菌克隆，命名为BAC  clone  CD45-DTR。 外源基因靶向整合至小鼠CD45外显子1位点的BAC克隆的筛选与鉴定，整合的示意 图如附图4所示。 菌落PCR筛选靶向插入IRES-DTR-PGK-EM7-Neo的大肠杆菌BAC  Clone：挑选XX个单 克隆分别于有10μl  ddH2O的1.5mL离心管，吹打混匀。取1μl菌液作为模板，利用正向引物 G H p A - F - T T C T G A G G C G G A A A G A A C C ( S E Q  I D  N O .1 5 ) 和反向引物C D 4 5 - R - TATTTTGAACAGAAGCAGTGTATGC(SEQ  ID  NO.16)作菌落PCR。剩余菌液加入含5mL  LB培养基 (含15μg/mL氯霉素,15μg/mL新霉素)的15mL离心管，37℃220rpm培养16h，pRed/ET在37℃时 会丢失。 菌落PCR反应体系如下： 9 CN 111607614 A 说　明　书 7/9 页 菌落PCR反应条件如下： PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，靶向插入IRES-DTR-PGK-EM7-Neo至DC-SIGN 外显子7位点的大肠杆菌BAC阳性克隆可见约1kb条带，如附图5所示， PCR鉴定正确的靶向插入外源基因的阳性BAC克隆剩余菌液离心后去上清，用20％ 甘油的LB培养基重悬，-80℃保存。 实施例2 插入CD45-DTR至小鼠胚胎干(ES)细胞： 小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)培养：MEFs(ATCC)培养和维持于MEF培养基，适时传代 和冻存。MEF培养基为DMEM培养基加入10％FBS、100U/ml青链霉素、0.05  mM  2巯基乙醇、2mM  L-谷氨酰胺。 Balb/c  ES细胞培养：MEFs细胞使用前用30Grayγ射线灭活处理作为滋养层细胞， 将Balb/c  ES细胞(Merck)接种至灭活的MEFs上，用ES培养基培养和维持。ES细胞长至70％ 丰度以1：3比例传代。ES培养基为DMEM培养基加入15％FBS、100U/ml青链霉素、1mM丙酮酸 钠、0.1mM非必需氨基酸、0.05mM  2巯基乙醇、2mM  L-谷氨酰胺、1μg/L白血病抑制因子 (LIF)。 ES细胞电转：ES细胞经胰酶消化收集后，经PBS清洗1次，用电转缓冲液重悬 (Millipore)，调整细胞密度至0.5X107/ml。将实施例1中制备的BAC  clone  CD45-DTR载体 经PI-SceI酶切线性化，将50μg线性化的打靶载体加入0.6mL上述ES细胞悬液，，并转移至 Eppendorf电转仪配套电转杯中，室温静置5min。利用 Electroporator  2510电 转仪320V  500μF电转，取出电转杯室温放置5min。转移至含30ml培养液的50ml离心管中混 匀，再均匀分配至事先准备好含滋养层细胞的3个10cm培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培 养，CD45-DTR插入目标基因的原理如附图4所示。 插入BAC  clone  CD45-DTR的ES细胞的筛选和鉴定：电转后的ES细胞在24小时后， 换成含800μg/ml培养液，此后每天更换含药物的培养液。连续药物处理7天后，在尼康 SMZ1500显微镜下用特制吸管挑取胚胎干细胞单克隆并转移至事先准备好的含滋养层细胞 及培养液的48孔培养板中，每种打靶载体各挑取12个左右单克隆，于37℃5％CO2培养箱中 10 CN 111607614 A 说　明　书 8/9 页 培养。24小时后，用胰酶消化挑取的单克隆细胞并转移至新的事先准备好的含滋养层细胞 及培养液的48孔培养板中，于37℃5％CO2培养箱中培养3-4天，每天换液。待单克隆细胞长 至80％丰度，细胞经胰酶消化后，将细胞悬液均分转移至事先准备好的含滋养层细胞及培 养液的24孔培养板中，并于37℃5％CO2培养箱中培养。待细胞丰度达70％，消化和收集ES细 胞，利用QIAamp  DNA  Mini  Kit(Qiagen)提取基因组DNA。以提取的小鼠ES细胞基因组DNA为 模板，利用正向引物ES-screen-F-ATTGCATCGCATTGTCTGAG(SEQ  ID  NO.17)和反向引物 ES-screen-R-CGAGTGGGGACTTACAGTGG(SEQ  ID  NO.18)进行PCR扩增。 PCR反应体系如下： PCR扩增条件为： PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，插入BAC  clone  CD45-DTR的ES细胞阳性克隆 可见约1.4kb条带，如附图6所示。阳性克隆ES细胞消化后用胚胎干细胞冻存液(Millipore) 重悬，-80℃冻存备用。 实施例3 繁育插入BAC  clone  CD45-DTR转基因小鼠，流程如附图7所示。 囊胚注射ES细胞获得CD45-DTR转基因嵌合体小鼠：选8周龄发育良好的C57BL/6J 公鼠，与C57BL/6J母鼠按1：2合笼，次日清晨挑选阴栓阳性母鼠，若母鼠怀孕5天后可在子宫 取得囊胚。将结扎KM公鼠与正常KM母鼠按1：2合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠，即 为假孕KM母鼠。将插入CD45-DTR的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠囊胚中，再接种到假孕的KM 母鼠子宫中，出生得到嵌合体小鼠(F0)，即C57来源的细胞和BALB/c来源的ES细胞共同存在 于同一个体中，表现为动物毛色为黑色和白色混杂。 提取小鼠鼠尾DNA方法：小鼠鼠尾置于1.5mL离心管，加入300μL  NaOH溶液(50mM)， 金属浴100℃30min。冷却至室温，加入30μL  Tris-HCl(1M,pH6.8)混匀调节pH。10000g离心 1min，上清即为含小鼠鼠尾DNA的溶液，可直接用于PCR。 鼠尾PCR鉴定转基因嵌合体小鼠：以转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，利用正向引物 CD45  DTR-screen-F-GGTGGTGCTGAAGCTCTTTC (SEQ  ID  NO.19)和反向引物CD45-DTR-screen-R-CCCATGACACCTCTCTCCAT 11 CN 111607614 A 说　明　书 9/9 页 (SEQ  ID  NO.20)作PCR扩增，PCR反应体系同实施例2，PCR扩增条件同实施例2。PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，插入IRES-DTR的阳性小鼠可见约0.4kb条带，如附图8所 示。 繁育CD45-DTR转基因小鼠：白色占比越高的嵌合体小鼠，ES细胞发育成生殖细胞 的可能性越大，利用白色占比最高的5只雄性转基因嵌合体小鼠与BALB/c雌鼠交配，得到的 CD45-DTR转基因杂合小鼠应为白色。小白鼠经鼠尾PCR鉴定后得到CD45-DTR转基因杂合小 鼠，即为F1代小鼠。鼠尾PCR鉴定方法同上。F1代小鼠与C57BL/6J母鼠杂交进行传代，培育。 培养方法按照常规小鼠饲养模式进行。 实施例4 CD45-DTR转基因小鼠经白喉毒素诱导建立清除免疫细胞的小鼠模型。 本实施例采用腹腔注射白喉毒素(DT)，检测小鼠淋脾脏中免疫细胞的占比来检测 免疫的敲除效率。 CD45-DTR转基因小鼠免疫细胞清除：CD45-DTR转基因小鼠在第1、第2、第4、第7天 分别腹腔注射DT(20ng/g)，小鼠生长状态无明显变化。对照组小鼠在第1、第4天用4.5Gray γ射线照射4小时。第8天用脱颈椎法处死小鼠，取小鼠表皮，用流式细胞术检测淋巴结中免 疫细胞情况。 流式细胞术检测脾脏中免疫细胞表达：获取小鼠表皮，制备成单细胞悬液，用2％ FCS-PBS重悬细胞，经Fc  blocker封闭Fc受体后，利用anti-mouse-CD45流式抗体染色，染色 完毕洗去多余抗体，单细胞悬液用CytoFLEX  LX  Flow  Cytometer上机检测。其中CD45代表 不同类型免疫细胞。经DT诱导后小鼠免疫细胞敲除如附图9所示，率约达80-90％，证明本发 明所述的方案能够很好的清除免疫细胞。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的 保护范围。 12 CN 111607614 A 序　列　表 1/8 页 SEQUENCE  LISTING <110> 乾元康安(苏州)生物科技有限公司 <120> 白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法与应用 <130>  2020 <160>  20 <170>  PatentIn  version  3.3 <210>  1 <211>  40 <212>  DNA <213> 人工 <223>  引物CD45-5HA-F(KpnI) <400>  1 accaccggta  ccgtgcaaag  tatgcgttct  tttcttttag  40 <210>  2 <211>  33 <212>  DNA <213> 人工 <223>  引物CD45  -5HA-R(SalI) <400>  2 aacaacgtcg  acatctggag  atcagctgtg  ccc  33 <210>  3 <211>  151 <212>  DNA <213> 人工 <223>  基因片段DCSIGN  5HA <400>  3 accaccggta  ccgtgcaaag  tatgcgttct  tttcttttag  ttttgactta  gctttacaga  60 gacaaacttc  aagagagata  accattattt  tgcctttcag  ggagacccta  tttcttaggg  120 gcacagctga  tctccagatg  tcgacgttgt  t  151 <210>  4 <211>  30 <212>  DNA <213> 人工 <223>  引物IRES-F(SalI) <400>  4 accaccgtcg  acgcccctct  ccctcccccc  30 <210>  5 <211>  27 13 CN 111607614 A 序　列　表 2/8 页 <212>  DNA <213> 人工 <223>  引物IRES-R <400>  5 catggttgtg  gcaagcttat  catcgtg  27 <210>  6 <211>  602 <212>  DNA <213> 人工 <223>  基因片段IRES <400>  6 accaccgtcg  agcccctctc  cctccccccc  ccctaacgtt  actggccgaa  gccgcttgga  60 ataaggccgg  tgtgcgtttg  tctatatgtt  attttccacc  atattgccgt  cttttggcaa  120 tgtgagggcc  cggaaacctg  gccctgtctt  cttgacgagc  attcctaggg  gtctttcccc  180 tctcgccaaa  ggaatgcaag  gtctgttgaa  tgtcgtgaag  gaagcagttc  ctctggaagc  240 ttcttgaaga  caaacaacgt  ctgtagcgac  cctttgcagg  cagcggaacc  ccccacctgg  300 cgacaggtgc  ctctgcggcc  aaaagccacg  tgtataagat  acacctgcaa  aggcggcaca  360 accccagtgc  cacgttgtga  gttggatagt  tgtggaaaga  gtcaaatggc  tctcctcaag  420 cgtattcaac  aaggggctga  aggatgccca  gaaggtaccc  cattgtatgg  gatctgatct  480 ggggcctcgg  tgcacatgct  ttacatgtgt  ttagtcgagg  ttaaaaaacg  tctaggcccc  540 ccgaaccacg  gggacgtggt  tttcctttga  aaaacacgat  gataagcttg  ccacaaccat  600 ga  602 <210>  7 <211>  42 <212>  DNA <213> 人工 <223>  引物DTR-F <400>  7 cacgatgata  agcttgccac  aaccatgaag  ctgctgccgt  cg  42 <210>  8 <211>  34 <212>  DNA <213> 人工 <223>  引物DTR-R(EcoRI) <400>  8 accaccgaat  tcttagtggg  aattagtcat  gccc  34 <210>  9 <211>  663 <212>  DNA 14 CN 111607614 A 序　列　表 3/8 页 <213> 人工 <223>  基因片段DTR <400>  9 cacgatgata  agcttgccac  aaccatgaag  ctgctgccgt  cggtggtgct  gaagctcttt  60 ctggctgcag  ttctctcggc  actggtgact  ggcgagagcc  tggagcggct  tcggagaggg  120 ctagctgctg  gaaccagcaa  cccggaccct  cccactgtat  ccacggacca  gctgctaccc  180 ctaggaggcg  gccgggaccg  gaaagtccgt  gacttgcaag  aggcagatct  ggaccttttg  240 agagtcactt  tatcctccaa  gccacaagca  ctggccacac  caaacaagga  ggagcacggg  300 aaaagaaaga  agaaaggcaa  ggggctaggg  aagaagaggg  acccatgtct  tcggaaatac  360 aaggacttct  gcatccatgg  agaatgcaaa  tatgtgaagg  agctccgggc  tccctcctgc  420 atctgccacc  cgggttacca  tggagagagg  tgtcatgggc  tgagcctccc  agtggaaaat  480 cgcttatata  cctatgacca  cacaaccatc  ctggccgtgg  tggctgtggt  gctgtcatct  540 gtctgtctgc  tggtcatcgt  ggggcttctc  atgtttaggt  accataggag  aggaggttat  600 gatgtggaaa  atgaagagaa  agtgaagttg  ggcatgacta  attcccacta  agaattcggt  660 ggt  663 <210>  10 <211>  1238 <212>  DNA <213> 人工 <223>  基因片段IRES-DTR <400>  10 accaccgtcg  acgcccctct  ccctcccccc  cccctaacgt  tactggccga  agccgcttgg  60 aataaggccg  gtgtgcgttt  gtctatatgt  tattttccac  catattgccg  tcttttggca  120 atgtgagggc  ccggaaacct  ggccctgtct  tcttgacgag  cattcctagg  ggtctttccc  180 ctctcgccaa  aggaatgcaa  ggtctgttga  atgtcgtgaa  ggaagcagtt  cctctggaag  240 cttcttgaag  acaaacaacg  tctgtagcga  ccctttgcag  gcagcggaac  cccccacctg  300 gcgacaggtg  cctctgcggc  caaaagccac  gtgtataaga  tacacctgca  aaggcggcac  360 aaccccagtg  ccacgttgtg  agttggatag  ttgtggaaag  agtcaaatgg  ctctcctcaa  420 gcgtattcaa  caaggggctg  aaggatgccc  agaaggtacc  ccattgtatg  ggatctgatc  480 tggggcctcg  gtgcacatgc  tttacatgtg  tttagtcgag  gttaaaaaac  gtctaggccc  540 cccgaaccac  ggggacgtgg  ttttcctttg  aaaaacacga  tgataagctt  gccacaacca  600 tgaagctgct  gccgtcggtg  gtgctgaagc  tctttctggc  tgcagttctc  tcggcactgg  660 tgactggcga  gagcctggag  cggcttcgga  gagggctagc  tgctggaacc  agcaacccgg  720 accctcccac  tgtatccacg  gaccagctgc  tacccctagg  aggcggccgg  gaccggaaag  780 tccgtgactt  gcaagaggca  gatctggacc  ttttgagagt  cactttatcc  tccaagccac  840 aagcactggc  cacaccaaac  aaggaggagc  acgggaaaag  aaagaagaaa  ggcaaggggc  900 tagggaagaa  gagggaccca  tgtcttcgga  aatacaagga  cttctgcatc  catggagaat  960 gcaaatatgt  gaaggagctc  cgggctccct  cctgcatctg  ccacccgggt  taccatggag  1020 agaggtgtca  tgggctgagc  ctcccagtgg  aaaatcgctt  atatacctat  gaccacacaa  1080 15 CN 111607614 A 序　列　表 4/8 页 ccatcctggc  cgtggtggct  gtggtgctgt  catctgtctg  tctgctggtc  atcgtggggc  1140 ttctcatgtt  taggtaccat  aggagaggag  gttatgatgt  ggaaaatgaa  gagaaagtga  1200 agttgggcat  gactaattcc  cactaagaat  tcggtggt  1238 <210>  11 <211>  34 <212>  DNA <213> 人工 <223>  引物CD45-3HA-F(BamHI) <400>  11 accaccggat  ccaccatggg  tttgtggctc  aaac  34 <210>  12 <211>  42 <212>  DNA <213> 人工 <223>  引物CD45-3HA-R(NotI) <400>  12 accaccgcgg  ccgcatccat  cacacgcaac  ttttaaaaat  ag  42 <210>  13 <211>  196 <212>  DNA <213> 人工 <223>  基因片段CD45  3HA <400>  13 accaccggat  ccaccatggg  tttgtggctc  aaacttctgg  cctttggatt  tgcccttctg  60 gacacagaag  tctttgtcac  aggtaagcac  acccatattc  atttttactt  ccttgtattt  120 tgttgatttt  gtggcaaagg  ctaggttgaa  atggctattt  ttaaaagttg  cgtgtgatgg  180 atgcggccgc  gttgtt  196 <210>  14 <211>  6307 <212>  DNA <213> 人工 <223> 打靶载体PL451-loxP  IRES-DTR  CD45  3HA  5HA <400>  14 ctaaattgta  agcgttaata  ttttgttaaa  attcgcgtta  aatttttgtt  aaatcagctc  60 attttttaac  caataggccg  aaatcggcaa  aatcccttat  aaatcaaaag  aatagaccga  120 gatagggttg  agtgttgttc  cagtttggaa  caagagtcca  ctattaaaga  acgtggactc  180 caacgtcaaa  gggcgaaaaa  ccgtctatca  gggcgatggc  ccactacgtg  aaccatcacc  240 ctaatcaagt  tttttggggt  cgaggtgccg  taaagcacta  aatcggaacc  ctaaagggag  300 cccccgattt  agagcttgac  ggggaaagcc  ggcgaacgtg  gcgagaaagg  aagggaagaa  360 16 CN 111607614 A 序　列　表 5/8 页 agcgaaagga  gcgggcgcta  gggcgctggc  aagtgtagcg  gtcacgctgc  gcgtaaccac  420 cacacccgcc  gcgcttaatg  cgccgctaca  gggcgcgtcc  cattcgccat  tcaggctgcg  480 caactgttgg  gaagggcgat  cggtgcgggc  ctcttcgcta  ttacgccagc  tggcgaaagg  540 gggatgtgct  gcaaggcgat  taagttgggt  aacgccaggg  ttttcccagt  cacgacgttg  600 taaaacgacg  gccagtgaat  tgtaatacga  ctcactatag  ggcgaattgg  gatccgtgca  660 aagtatgcgt  tcttttcttt  tagttttgac  ttagctttac  agagacaaac  ttcaagagag  720 ataaccatta  ttttgccttt  cagggagacc  ctatttctta  ggggcacagc  tgatctccag  780 atgtcgacgc  ccctctccct  cccccccccc  taacgttact  ggccgaagcc  gcttggaata  840 aggccggtgt  gcgtttgtct  atatgttatt  ttccaccata  ttgccgtctt  ttggcaatgt  900 gagggcccgg  aaacctggcc  ctgtcttctt  gacgagcatt  cctaggggtc  tttcccctct  960 cgccaaagga  atgcaaggtc  tgttgaatgt  cgtgaaggaa  gcagttcctc  tggaagcttc  1020 ttgaagacaa  acaacgtctg  tagcgaccct  ttgcaggcag  cggaaccccc  cacctggcga  1080 caggtgcctc  tgcggccaaa  agccacgtgt  ataagataca  cctgcaaagg  cggcacaacc  1140 ccagtgccac  gttgtgagtt  ggatagttgt  ggaaagagtc  aaatggctct  cctcaagcgt  1200 attcaacaag  gggctgaagg  atgcccagaa  ggtaccccat  tgtatgggat  ctgatctggg  1260 gcctcggtgc  acatgcttta  catgtgttta  gtcgaggtta  aaaaacgtct  aggccccccg  1320 aaccacgggg  acgtggtttt  cctttgaaaa  acacgatgat  aatatggcca  caaccatgaa  1380 gctgctgccg  tcggtggtgc  tgaagctctt  tctggctgca  gttctctcgg  cactggtgac  1440 tggcgagagc  ctggagcggc  ttcggagagg  gctagctgct  ggaaccagca  acccggaccc  1500 tcccactgta  tccacggacc  agctgctacc  cctaggaggc  ggccgggacc  ggaaagtccg  1560 tgacttgcaa  gaggcagatc  tggacctttt  gagagtcact  ttatcctcca  agccacaagc  1620 actggccaca  ccaaacaagg  aggagcacgg  gaaaagaaag  aagaaaggca  aggggctagg  1680 gaagaagagg  gacccatgtc  ttcggaaata  caaggacttc  tgcatccatg  gagaatgcaa  1740 atatgtgaag  gagctccggg  ctccctcctg  catctgccac  ccgggttacc  atggagagag  1800 gtgtcatggg  ctgagcctcc  cagtggaaaa  tcgcttatat  acctatgacc  acacaaccat  1860 cctggccgtg  gtggctgtgg  tgctgtcatc  tgtctgtctg  ctggtcatcg  tggggcttct  1920 catgtttagg  taccatagga  gaggaggtta  tgatgtggaa  aatgaagaga  aagtgaagtt  1980 gggcatgact  aattcccact  aaacgcgtac  cgggcccccc  ctcgaggtcg  acggtatcga  2040 taagcttgat  atcgaattcc  gaagttccta  ttctctagaa  agtataggaa  cttcaggtct  2100 gaagaggagt  ttacgtccag  ccaagctagc  ttggctgcag  gtcgtcgaaa  ttctaccggg  2160 taggggaggc  gcttttccca  aggcagtctg  gagcatgcgc  tttagcagcc  ccgctgggca  2220 cttggcgcta  cacaagtggc  ctctggcctc  gcacacattc  cacatccacc  ggtaggcgcc  2280 aaccggctcc  gttctttggt  ggccccttcg  cgccaccttc  tactcctccc  ctagtcagga  2340 agttcccccc  cgccccgcag  ctcgcgtcgt  gcaggacgtg  acaaatggaa  gtagcacgtc  2400 tcactagtct  cgtgcagatg  gacagcaccg  ctgagcaatg  gaagcgggta  ggcctttggg  2460 gcagcggcca  atagcagctt  tgctccttcg  ctttctgggc  tcagaggctg  ggaaggggtg  2520 ggtccggggg  cgggctcagg  ggcgggctca  ggggcggggc  gggcgcccga  aggtcctccg  2580 gaggcccggc  attctgcacg  cttcaaaagc  gcacgtctgc  cgcgctgttc  tcctcttcct  2640 catctccggg  cctttcgacc  tgcagcctgt  tgacaattaa  tcatcggcat  agtatatcgg  2700 17 CN 111607614 A 序　列　表 6/8 页 catagtataa  tacgacaagg  tgaggaacta  aaccatggga  tcggccattg  aacaagatgg  2760 attgcacgca  ggttctccgg  ccgcttgggt  ggagaggcta  ttcggctatg  actgggcaca  2820 acagacaatc  ggctgctctg  atgccgccgt  gttccggctg  tcagcgcagg  ggcgcccggt  2880 tctttttgtc  aagaccgacc  tgtccggtgc  cctgaatgaa  ctgcaggacg  aggcagcgcg  2940 gctatcgtgg  ctggccacga  cgggcgttcc  ttgcgcagct  gtgctcgacg  ttgtcactga  3000 agcgggaagg  gactggctgc  tattgggcga  agtgccgggg  caggatctcc  tgtcatctca  3060 ccttgctcct  gccgagaaag  tatccatcat  ggctgatgca  atgcggcggc  tgcatacgct  3120 tgatccggct  acctgcccat  tcgaccacca  agcgaaacat  cgcatcgagc  gagcacgtac  3180 tcggatggaa  gccggtcttg  tcgatcagga  tgatctggac  gaagagcatc  aggggctcgc  3240 gccagccgaa  ctgttcgcca  ggctcaaggc  gcgcatgccc  gacggcgagg  atctcgtcgt  3300 gacccatggc  gatgcctgct  tgccgaatat  catggtggaa  aatggccgct  tttctggatt  3360 catcgactgt  ggccggctgg  gtgtggcgga  ccgctatcag  gacatagcgt  tggctacccg  3420 tgatattgct  gaagagcttg  gcggcgaatg  ggctgaccgc  ttcctcgtgc  tttacggtat  3480 cgccgctccc  gattcgcagc  gcatcgcctt  ctatcgcctt  cttgacgagt  tcttctgagg  3540 ggatcaattc  tctagagctc  gctgatcagc  ctcgactgtg  ccttctagtt  gccagccatc  3600 tgttgtttgc  ccctcccccg  tgccttcctt  gaccctggaa  ggtgccactc  ccactgtcct  3660 ttcctaataa  aatgaggaaa  ttgcatcgca  ttgtctgagt  aggtgtcatt  ctattctggg  3720 gggtggggtg  gggcaggaca  gcaaggggga  ggattgggaa  gacaatagca  ggcatgctgg  3780 ggatgcggtg  ggctctatgg  cttctgaggc  ggaaagaacc  agctggggct  cgactagagc  3840 ttgcggaacc  cttcgaagtt  cctattctct  agaaagtata  ggaacttcat  cagtcaggta  3900 cataatggat  ctaccatggg  tttgtggctc  aaacttctgg  cctttggatt  tgcccttctg  3960 gacacagaag  tctttgtcac  aggtaagcac  acccatattc  atttttactt  ccttgtattt  4020 tgttgatttt  gtggcaaagg  ctaggttgaa  atggctattt  ttaaaagttg  cgtgtgatgg  4080 atgcggccgc  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agtccaaccc  ggtaagacac  gacttatcgc  cactggcagc  agccactggt  4920 aacaggatta  gcagagcgag  gtatgtaggc  ggtgctacag  agttcttgaa  gtggtggcct  4980 aactacggct  acactagaag  aacagtattt  ggtatctgcg  ctctgctgaa  gccagttacc  5040 18 CN 111607614 A 序　列　表 7/8 页 ttcggaaaaa  gagttggtag  ctcttgatcc  ggcaaacaaa  ccaccgctgg  tagcggtggt  5100 ttttttgttt  gcaagcagca  gattacgcgc  agaaaaaaag  gatctcaaga  agatcctttg  5160 atcttttcta  cggggtctga  cgctcagtgg  aacgaaaact  cacgttaagg  gattttggtc  5220 atgagattat  caaaaaggat  cttcacctag  atccttttaa  attaaaaatg  aagttttaaa  5280 tcaatctaaa  gtatatatga  gtaaacttgg  tctgacagtt  accaatgctt  aatcagtgag  5340 gcacctatct  cagcgatctg  tctatttcgt  tcatccatag  ttgcctgact  ccccgtcgtg  5400 tagataacta  cgatacggga  gggcttacca  tctggcccca  gtgctgcaat  gataccgcga  5460 gacccacgct  caccggctcc  agatttatca  gcaataaacc  agccagccgg  aagggccgag  5520 cgcagaagtg  gtcctgcaac  tttatccgcc  tccatccagt  ctattaattg  ttgccgggaa  5580 gctagagtaa  gtagttcgcc  agttaatagt  ttgcgcaacg  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